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RNA-seq数据分析
简介1 生物基础1.1 中心法则1.2 RNA-seq Protocol1.3 RNA-seq总的路线图
2 数据分析2.1 前期准备2.1.1 创建目录&安装conda2.1.2 常用文件格式简介
2.2 软件安装2.2.1 conda安装软件2.2.2 预编译版本软件安装2.2.3 源码安装
2.3 数据下载
下载完成之后一定要检查数据完整性,不然分析白做使用awk命令提取md5值,生成md5文件,运行以下命令检查文件完整性2.5 质控(QC)2.6 去接头2.7 hisat2比对2.8 定量和转录本组装
参考
简介
基因表达是功能基因组学研究的一个重要领域。基因表达与基因信息从基因组DNA到功能蛋白产物的流动有关。RNA-seq已成为一种标准的基因表达检测方法,尤其用于检测转录本相对丰度和多样性。已有研究表明,其可靠性可以与其他成熟的方法如定量聚合酶链式反应(qPCR)相媲美。 声明: 文中如有不足请留言讨论! 1 生物基础吐槽: 系统性总结真的好困难,刚开始阅读文献也很吃力。但是行动是知识特有的果实,慢慢积累吧。 1.1 中心法则中心法则对于学习生物的人来说再熟悉不过了,基因信息的流动,蛋白的产生等一系列生物学事件都基于中心法则,是基因表达分析的一条主线。遗传信息从双链基因组DNA模板到翻译后修饰蛋白的流动是每个阶段至关重要的分子特征。RNA-seq通常针对成熟的mRNA分子。
典型的RNA-seq流程包括从感兴趣的样本中分离RNA、建库、高通量测序产生数以百万计的reads(长度一般为30-300bp)、比对到参考基因组或转录组,差异表达分析、发现转录本亚型和其它的下游分析。下图很好的概括了RNA-seq数据产生的过程。
这张图引自A survey of best practices for RNA-seq data analysis。包括了三个板块,分别是预分析,核心分析和高级分析。很好的概括了实验设计和拿到测序reads后的数据分析,并介绍了不同的分析路线和每一步的数据分析方法,可以说是一个很好的大纲。 注意: 这里省略了进入相关文件目录的步骤,大家分析时要注意。本次数据是小鼠早期胚胎测序得到的双末端数据,单末端相关参数可以使用–help查看帮助文档。但分析总体流程相同。 我使用的是HISAT2+featureCounts+StringTie流程。 2.1 前期准备 2.1.1 创建目录&安装conda创建目录 # 首先使用cd命令需要进入自己的目录 cd ~/ # 创建文件夹,用于存储参考基因组 mkdir -p /mnt/data/hwb/database/mouse_genome_esml_84/grcm38_tran/ # 建立软件安装目录 mkdir biosoft # 此外还需要建立项目分析的目录以及备份文件,方便查找conda安装 Conda 是一种通用包管理系统,旨在构建和管理任何语言的任何类型的软件。通常与 Anaconda (集成了更多软件包,https://www.anaconda.com/download/#download) 和 Miniconda(只包含基本功能软件包, https://conda.io/miniconda. html) 一起分发。 # 从官网下载最新版Miniconda3安装包,但速度较慢 wget -c https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh # 安装Miniconda3:安装过程只需要输入 yes 或者按 Enter bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh # miniconda3安装成功,并成功配置好环境变量 source ~/.bashrc # 镜像设置 # 下面这四行配置清华大学的bioconda的channel地址,国内用户推荐 conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/main/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/ # 配置镜像成功 conda config --set show_channel_urls yes conda config --set channel_priority flexible # 查看配置文件 cat ~/.condarcconda常用命令 conda create -y -n trans python=3 # 创建小环境并成功安装python3 conda info --e # 查看当前conda环境 conda-env list # 列出所有小环境 conda activate trans # 激活小环境 conda deactivate # 退出小环境 2.1.2 常用文件格式简介1. SRA:NCBI SRA数据库存放格式 SRA(Sequence Read Archive):SRA是一个数据库,NCBI为了解决高通量数据庞大的存储压力而设计的一种数据压缩方案。 一般使用fastq-dump或fasterq-dump来将其转换为fastq格式的数据,才能做后续分析。 2. FASTQ:高通量数据存储格式 FASTQ格式将序列和Phred质量存储在一个文件中。序列和质量得分皆由单个ASCII字符编码。最早由Sanger Institute开发使用,目前已经是高通量测序结果的标准格式。 Phred质量值简介: fasta序列格式如下: 必须包含的3列: (1). chrom - 染色体名字(e.g. chr3,chrY, chr2_random)或scafflold 的名字(e.g. scaffold0671 )。 (2). chromStart - 染色体或scaffold的起始位置,染色体第一个碱基的位置是0。 (3). chromEnd - 染色体或scaffold的结束位置,染色体的末端位置没有包含到显示信息里面。例如,首先得100个碱基的染色体定义为chromStart =0 .chromEnd=100, 碱基的数目是0-99。 9 个额外的可选列: (4). name - 指定BED行的名字,这个名字标签会展示在基因组浏览器中的bed行的左侧。 (5). score - 0到1000的分值,如果在注释数据的设定中将原始基线设置为1,那么这个分值会决定现示灰度水平(数字越大,灰度越高),下面的这个表格显示GenomeBrowser
这里介绍三种软件安装方法。 2.2.1 conda安装软件 # 可以一次安装多个软件 conda install -y -c hcc aspera-cli conda install -y sra-tools conda install -y fastqc trim-galore hisat2 multiqc samtools featureCounts # 运行以下命令,检查软件是否安装成功 hisat2 --help which ascp # 查看软件安装路径 2.2.2 预编译版本软件安装 # 以aspera为例 wget -c https://d3gcli72yxqn2z.cloudfront.net/connect_3_9_1_171801_ga/bin/ibm-aspera-connect-3.9.1.171801-linux-g2.12-64.tar.gz # 解压并运行脚本 tar -xzf ibm-aspera-connect-3.8.1.161274-linux-g2.12-64.tar.gz bash ibm-aspera-connect-3.8.1.161274-linux-g2.12-64.sh # 添加环境变量 export PATH=~/.aspera/connect/bin:\$PATH >>~/.bashrc # source使变量生效 source ~/.bashrc 2.2.3 源码安装 # 首先使用wget下载 # 安装分三步: # 配置 ./configure --prefix=想要指定的路径 # 编译 make # 安装 make install # 具体的安装在下载之后可以查看readme文件,一般有详细的介绍 2.3 数据下载我这里使用aspera下载sra数据。 首先我们通过阅读文章获取数据的GEO accession,在GEO数据库中找到对应的BioProject,这里建议在ebi数据库下载对应的SRR号的相关信号,并获取aspera下载链接以及md5值等相关信息。 # ------------------------------------------------------ # GEO accession:GSE70605 # ------------------------------------------------------ # 下载得到tsv文件首先需要使用awk命令提取文件内aspera链接,保存为srr.aspra文件。之后运行下面脚本 创建一个脚本,命名为aspera.sh: ```bash # 找到openssh文件位置,替换以下代码文件路径 find /home/hwb/ -name asperaweb_id_dsa.openssh #!/bin/bash cat srr.aspera | while read id do ascp -QT -l 300m -P33001 -i ~/miniconda3/envs/aspera/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@${id} ./ done # 运行脚本: ./aspera.sh 下载完成之后一定要检查数据完整性,不然分析白做 使用awk命令提取md5值,生成md5文件,运行以下命令检查文件完整性md5sum -c md5 md5文件如下图: ![在这里插入图片描述](https://img-blog.csdnimg.cn/20200821200722787.PNG#pic_center) ## 2.4 sra2fastq 将sra文件转换为fastq文件 ```bash 创建脚本文件,个人觉得这样很方便。方便下次使用 #!bin/bash cat srr.list | while read id do nohup fastq-dump --split-3 $id -O ./ & done 2.5 质控(QC)这一步生成的是HTML文件,可以用浏览器打开查看。其中,各种颜色是各项标准分析结果:绿色代表"PASS";黄色代表"WARN";红色代表"FAIL"。 ls ../raw/*.fastq|xargs fastqc -t 10 -o ./ multiqc ./# 整合质控结果去接头完成之后,一定要再次质控,确保数据tidy 同样,写个简单的脚本 #!/bin/bish # paired sequence # trim adapter paste ../clean/trim.log & done 2.7 hisat2比对我这里使用的是HISAT2,index是在HISAT2官网下载的。所以省去了建index的步骤。hisat2的index有八个文件。这里建议新手将参考基因组的fa文件,注释gtf文件和index文件放在同一文件夹下,不然报错很难找。 |
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