自分泌Galectin

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摘要：

研究背景与目的: 结肠癌发生转移是致使晚期结肠癌患者预后不良和导致死亡的主要原因之一.结肠癌细胞发生侵袭转移的分子机制一直是科学家们研究的热点.上皮间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)学说在肿瘤细胞侵袭转移机制的多种假说中较为热门.该假说提出肿瘤细胞EMT后,侵袭转移能力增强.近年,肿瘤微环境在肿瘤复发和转移中的作用日益受到重视.巨噬细胞是肿瘤微环境中浸润较早,数目较多的免疫细胞,也是微环境中细胞因子的主要来源.巨噬细胞可塑性强,在不同的细胞因子作用下可以分化为不同的亚型.不同类型的巨噬细胞对肿瘤细胞的作用不同.单核细胞定值于巨噬细胞后,分化成为未活化的巨噬细胞M0,根据其活化途径的不同,巨噬细胞可以分为两大类:M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞.M1型巨噬细胞发挥诱发炎症反应,吞噬并杀伤肿瘤细胞的作用;M2亚型巨噬细胞则主要抑制炎症反应,并可促进肿瘤细胞增殖,促进血管新生.以肿瘤相关巨噬细胞为主要代表的肿瘤微环境也参与了促进肿瘤细胞发生EMT的过程.微环境中的多种细胞因子可以诱导肿瘤细胞出现上皮间质化转变,而肿瘤细胞反过来亦可对其所处的微环境进行调控,以适应自身生存.这其中涉及多种细胞成分以及细胞因子,是一个庞大而复杂的调控网络,其中的具体机制至今仍尚未探明. S100A8是钙离子结合蛋白S100家族的成员,是一种急性反应蛋白.大量的研究证实其作为一种"损伤模式蛋白",在机体受到侵害的早期即出现表达升高.在我们前期的实验中发现,炎症相关结直肠癌小鼠模型中,S100A8的表达增高早于Galectin-3(Gal-3),且S100A8可以激活巨噬细胞内NF-κB通路和PI3K/AKT通路,产生大量细胞因子,影响结肠癌细胞恶性生物学行为. Galectin-3(Gal-3)是半乳糖凝集素家族成员,广泛表达于肿瘤细胞和免疫细胞的细胞核,细胞质,并可以分泌到细胞外基质.在细胞外,Gal-3可以通过与各种免疫细胞表面的聚糖结合,发挥刺激细胞因子产生,促进细胞粘附,影响细胞趋化以及凋亡的作用.在细胞内Gal-3可以通过参与信号通路调节细胞各种生物反应.可见Gal-3对肿瘤微环境及肿瘤细胞本身均有一定的作用.我们的前期研究也发现Gal-3高表达于结肠癌肿瘤组织和结肠癌肿瘤间质,与结肠癌远处转移及淋巴结转移密切相关.但Galectin-3发挥作用的具体机制尚未探明.在本研究中,我们对Gal-3在结肠癌中高表达的机制以及其高表达后对肿瘤微环境中的巨噬细胞和肿瘤细胞又会产生什么影响进行了初步研究. 研究方法: (1)通过将THP-1细胞予Phorbol-12-myristat-13-acetate(PMA)体外诱导的方法,使其分化成为M0型巨噬细胞,用外源性S100A8重组蛋白刺激巨噬细胞24h后,分别收集细胞总蛋白和培养上清,采用westenblot和ELISA的方法分别检测阻断STAT3/IL-6信号通路前后IL-6,Gal-3的表达和STAT3磷酸化水平;分析微环境中S100A8对巨噬细胞分泌Gal-3的调节及其机制. (2)同样将THP-1细胞体外用PMA诱导成为M0型巨噬细胞,用Gal-3刺激3h,6h,12h,24h,48h后,收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测细胞因子IL-6,IL-12,INF-γ,IL-10,TGF-β表达改变,并与LPS诱导成为的M1型巨噬细胞和IL-4诱导成为的M2型巨噬细胞进行比较,检测其细胞因子表达的特点;收集Gal-3刺激24小时后的巨噬细胞,流式细胞技术检测单核巨噬细胞表面特异性标志物CD68和M2型巨噬细胞特异性表面分子CD163的表达,分析Gal-3对巨噬细胞分化的影响. (3)收集外源性Gal-3重组蛋白刺激巨噬细胞24h后的培养上清,与结肠癌细胞SW480共培养,观察SW480细胞24h,48h时形态改变,划痕实验测其迁移能力改变,trsanswell法测其侵袭力变化,westenblot方法测SW480细胞EMT相关分子E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Twist的表达,探究经Gal-3刺激后的巨噬细胞对结直肠癌EMT,侵袭,迁移能力的影响. (4)收集共培养后结肠癌细胞上清,检测上清中CCL20,CXCL5的表达变化分析微环境中巨噬细胞对结肠癌细胞趋化其他免疫细胞的能力可能存在的影响. 实验结果: (1)Westenblot和ELISA结果均显示外源性S100A8蛋白刺激后的巨噬细胞中及培养上清中Gal-3的表达较未处理的巨噬细胞明显升高,IL-6的表达和STAT3磷酸化水平(p-STAT3)显著升高,与未处理的巨噬细胞相比较差异具有统计学意义(P (2)流式细胞实验结果显示Gal-3刺激后的巨噬细胞CD163表达增高,CD68(+)CD163(+)细胞比例增加,但作用没有IL-4诱导组显著.ELISA结果显示Gal-3刺激后的巨噬细胞上清中IL-10,TGF-β,IL-6明显升高(P0.05).Gal-3诱导后的巨噬细胞分泌细胞因子的表达更接近于IL-4诱导分化的M2型巨噬细胞. (3)Gal-3刺激后巨噬细胞的条件培养基与结肠癌细胞SW480共培养可诱导SW480细胞出现形态改变,由椭圆形变为梭形,细胞体积增大,细胞间隙增宽,出现间质化改变.Transwell实验结果显示共培养后的SW480细胞穿过基质胶透过小室膜的细胞数明显高于对照组(P (4)与未用Gal-3刺激的巨噬细胞相比,Gal-3刺激后的巨噬细胞的条件培养基与SW480细胞共培养后,可诱导SW480分泌至培养上清中CCL20和CXCL5的浓度明显升高. 结论: (1)微环境中的S100A8可能作为Gal-3的上游调控因子,可激活巨噬细胞中STAT3/IL-6信号通路上调Gal-3的表达. (2)微环境中的Gal-3可以促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化. (3)Gal-3激活后的巨噬细胞可以通过诱导结肠癌细胞发生EMT,增强其侵袭转移能力. (4)结肠癌细胞受到Gal-3激活后的巨噬细胞的调控后,可能通过增加CCL20,CXCL5等趋化因子的分泌调节微环境的构成进一步形成适合其生长并进行免疫逃避的微环境.

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关键词：

结肠癌 肿瘤微环境 巨噬细胞 上皮-间质转化

年份：

2016