一种联合检测风湿三项的试剂盒及其制备方法【掌桥专利】

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种联合检测风湿三项的试剂盒及其制备方法。

背景技术

类风湿因子(RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，类风湿性关节炎(RA)病人和约50%的健康人体内有产生RF的B细胞克隆，在如变性IgG或EB病毒等病理因素直接作用下，可大量合成产生RF。RF与天然IgG结合能力较差，但易与免疫复合物中的IgG或聚合IgG反应。RF有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE 5种类型，检测RF对类风湿性关节炎(RA)的诊断、分型和疗效观察有重要意义，目前医院对风湿病进行检查时，主要开展风湿三项检查，除了对RF指标检测，还需要同时对ASO和CRP指标进行检测，由于对同一个病人分别要进行三项指标检测，操作起来费时费力，且等待检测结果时间较长，检测效率低。

抗溶血性链球菌“O”（baiAnti-Streptolysin “O”，简称ASO）是A族溶血性链球菌的重要代谢产物之一，它是一种具有溶血活性的蛋白质，能溶解人及一些动物的红细胞，同时溶血性链球菌“O”具有抗原性，能刺激机体产生相应的抗体，诊断溶血性链球菌感染症，活动性风湿热，猩红热，丹毒等均可呈现增高。ASO俗称抗“O”，测定其变化可知病人最近或以前有无溶血性链球菌感染。鉴于A组溶血性链球菌感染相当常见，故正常人能测到ASO的低滴度，但一般在500U以下。 ASO增高常见于急性咽炎等上呼吸道感染，儿童多见。还可见于皮肤急软组织感染；风湿性心肌炎、心包炎、风湿性关节炎，急性肾小球肾炎，ASO滴度也会呈现升高，多次检验所呈现的趋势与病情平行，如渐渐下降提示病情好转；另外A组溶血性链球菌所致败血症、菌血症心内膜炎等ASO均可呈现升高。

C反应蛋白（C-reactive protein,简称CRP）是指在机体收到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质，属于急性蛋白；CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种可同时检测类型多、检测效率高、操作简单及易于结果观察识别的联合检测风湿三项的试剂盒及其制备方法。

下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下：

RF是指类风湿因子；ASO是指一种抗溶血性链球菌；CRP是指一种C反应蛋白；

MES是一种2-(N-吗啡啉)乙磺酸组成的生物缓冲液；

Tris是一种一种生物缓冲试剂；

BSA是牛血清白蛋白；

Na2HPO4·12H2O是十二水合磷酸氢二钠；

NaH2PO4·2H2O是水合磷酸二氢钠；

NaCl是氯化钠；

EDC是指（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取；

Rpm是Revolutions Per Minute的英文缩写，即转每分，表示设备每分钟的旋转次数；

mM是指mmol/L，属于一种浓度单位；

SLO是指溶血素O。

为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案。

一种联合检测风湿三项的试剂盒，具体包括样品垫、结合垫、 NC膜、吸水垫、底板、RF检测线、ASO检测线、CRP检测线、质控线、加样孔和卡壳，所述卡壳内底部安装有底板；所述底板的中部设置有NC膜；所述NC膜的左侧端部设置有结合垫；所述结合垫的左侧安装有样品垫；所述NC膜的左侧端部设置有吸水垫；所述NC膜的上表面自左而右依次设置有RF检测线、ASO检测线、CRP检测线和质控线；所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫按顺序依次安装在底板上面；所述样品垫右端与结合垫的左端之间、所述结合垫的右端与NC膜的左端之间、所述NC膜的右端与吸水垫的左端之间均有不低于两毫米的重合段；所述卡壳的上表面在与样品垫的对应上方所在位置开设有加样孔；所述卡壳的上表面在与NC膜的对应上方所在位置开设有观察口。

作为本发明的进一步改进，所述结合垫上同时包含有RF微球分子、ASO微球分子和CRP微球分子物质。

作为本发明的进一步改进，所述RF检测线、ASO检测线、CRP检测线与质控线的相邻间隔设置的距离均相同。

一种联合检测风湿三项的试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤S1：首先进行包被液的配制，称量10.15g的MES于烧杯中，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整PH至6.0，然后定容到1L，保存备用；

步骤S2：再进行封闭液的配制，称取3.15g甘氨酸和10g酪蛋白，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整PH至8.0，然后定容到1L，保存备用；

步骤S3：然后进行微球重悬液的配置，称量6.05g的Tris，10g的BSA加入烧杯中，先加入900ml纯水溶解，搅拌混匀后，调整PH至8.0，再用1L纯化水定容，保存备用；

步骤S4：结合垫处理液配置，称量6.05g的Tris，10g的BSA，30g蔗糖和1ml吐温-20加入烧杯中，先加入900ml纯水溶解，搅拌混匀后，调整PH至8.0，再用1L纯化水定容，保存备用；

步骤S5：样本稀释液的配制，称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，依次称取0.272g的 NaH2PO4·2H2O、7.948g的NaCl，1ml的吐温-20，5g的BSA加入上述烧杯中，用1L纯化水定容，搅拌混匀后，调整PH至7.4；

步骤S6：微球活化，取25ul荧光微球加入到0.5mL的所述步骤S1中调配好的MES溶液中，然后向胶乳中加入15ug EDC，活化15min，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用pH 6.0的50mM的MES重悬，得到活化的荧光微球溶液；

步骤S7：RF胶乳制备，将12ug的人变性IgG加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用所述步骤S2中调配好的甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在所述步骤S2中调配好的Tris缓冲液中，得到溶液为即为RF荧光微球溶液；

步骤S8：ASO胶乳制备，将5ug SLO加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用含所述步骤S2中调配好的甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在所述步骤S2中调配好的Tris缓冲液中，得到溶液为即为ASO荧光微球溶液；

步骤S9：CRP胶乳制备，将12ug CRP加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用所述步骤S2中调配好的甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在所述步骤S2中调配好的Tris缓冲液中，得到溶液为即为CRP荧光微球溶液；

步骤S10：将步骤S7、步骤S8与步骤S9所得到的各个荧光微球溶液分别按体积1：1：1进行混合调配，并且搅拌均匀待用；

步骤S11：结合垫的制备，将已经预处理好的玻璃纤维素膜作为结合垫，将步骤S10制备的荧光微球混合液按照2ul/cm喷涂在结合垫上，45摄氏度干燥6小时；

步骤S12：NC膜的制备，分别将人变性IgG、ASO和CRP抗体稀释到1mg/ml，以1.0ul/cm的喷量依次喷涂在NC膜上已划好分割线的不同区域形成RF检测线、ASO检测线和CRP检测线，划好线的NC膜放置在45℃烘箱中干燥6h；

步骤S13：将样品垫、喷好微球混合溶液的结合垫、划线后的NC膜和吸水垫依次搭接粘贴在PVC底板上，保持各片材接头处均有2.0mm的重合长度，最后经过裁剪并封装到卡壳中即得到风湿三项联合检测试纸条。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S6所选用荧光微球的原浓度为10mg/ml。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S1至步骤S4中备用保存的温度均设定为4℃环境保存。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S13裁剪的试纸条尺寸具体为长6.0cm、宽3.5mm。

由于上述技术方案的运用，本技术方案具有的有益技术效果：本技术方案通过将三个检测指标所对应经制备好的胶乳溶液按比例调配处理，并且检测试纸条只需一根，这样可以达到真正意义上的一次上样同时出来三个检测结果，可以极大的降低试纸条生产成本，同时节约仪器改造成本，并且使用户在进行检测时操作简单方便，只需要进行单次上样，对样本量需求量较少，同时缩短加样时间和检测等待时间；本技术方案还通过利用详尽分步骤制备相关包被液、封闭液以及微球重悬液等处理，为后续对应三个不同的RF荧光微球溶液、ASO荧光微球溶液以及CRP荧光微球溶液制备搭配垫定了基础，可保证相关检测反应的及时准确性；本技术方案还将上述三种溶液搭配后按要求进行均匀喷洒到相应的纸质不同区域并划线予以区分，这样就可以实现对检测样本自左而右依次进行物质反应及指标显示，提高了检测的便利性同时也便于结果观察记录，有效提高了检测精确度及检测工作效率。

附图说明

图1为本发明的内部试纸条结构示意图。

图2为本发明组装后整体结构示意图。

图中：1、样品垫；2、结合垫； 3、NC膜；4、吸水垫；5、底板；6、RF检测线；7、ASO检测线；8、CRP检测线；9、质控线；10、加样孔；11、卡壳。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种联合检测风湿三项的试剂盒，具体包括样品垫1、结合垫2、 NC膜3、吸水垫4、底板5、RF检测线6、ASO检测线7、CRP检测线8、质控线9、加样孔10和卡壳11，所述卡壳11内底部安装有底板5；所述底板5的中部设置有NC膜3；所述NC膜3的左侧端部设置有结合垫2；所述结合垫2的左侧安装有样品垫1；所述NC膜3的左侧端部设置有吸水垫4；所述NC膜3的上表面自左而右依次设置有RF检测线6、ASO检测线7、CRP检测线8和质控线9；所述样品垫1、结合垫2、NC膜3和吸水垫4按顺序依次安装在底板上面；所述样品垫1右端与结合垫2的左端之间、所述结合垫2的右端与NC膜3的左端之间、所述NC膜3的右端与吸水垫4的左端之间均有不低于两毫米的重合段；所述卡壳11的上表面在与样品垫1的对应上方所在位置开设有加样孔10；所述卡壳11的上表面在与NC膜3的对应上方所在位置开设有观察口。

所述结合垫2上同时包含有RF微球分子、ASO微球分子和CRP微球分子物质；所述RF检测线6、ASO检测线7、CRP检测线8与质控线9的相邻间隔设置的距离均相同。

一种联合检测风湿三项的试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤S1：首先进行包被液的配制，称量10.15g的MES于烧杯中，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整PH至6.0，然后定容到1L，保存备用；

步骤S2：再进行封闭液的配制，称取3.15g甘氨酸和10g酪蛋白，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整PH至8.0，然后定容到1L，保存备用；

步骤S3：然后进行微球重悬液的配置，称量6.05g的Tris，10g的BSA加入烧杯中，先加入900ml纯水溶解，搅拌混匀后，调整PH至8.0，再用1L纯化水定容，保存备用；

步骤S4：结合垫处理液配置，称量6.05g的Tris，10g的BSA，30g蔗糖和1ml吐温-20加入烧杯中，先加入900ml纯水溶解，搅拌混匀后，调整PH至8.0，再用1L纯化水定容，保存备用；

步骤S5：样本稀释液的配制，称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，依次称取0.272g的 NaH2PO4·2H2O、7.948g的NaCl，1ml的吐温-20，5g的BSA加入上述烧杯中，用1L纯化水定容，搅拌混匀后，调整PH至7.4；

步骤S6：微球活化，取25ul荧光微球加入到0.5mL的pH为6.0的50mM的MES溶液中，然后向胶乳中加入15ug EDC，活化15min，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用pH 6.0的50mM的MES重悬，得到活化的荧光微球溶液；

步骤S7：RF胶乳制备，将12ug的人变性IgG加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用含1%酪蛋白的50mM甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在PH8.0且含有1%的BSA的50mM Tris缓冲液中，得到溶液为即为RF荧光微球溶液；

步骤S8：ASO胶乳制备，将5ug SLO加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用含1%酪蛋白的50mM甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在PH8.0且含有1%BSA的50mM Tris缓冲液中，得到溶液为即为ASO荧光微球溶液；

步骤S9：CRP胶乳制备，将12ug CRP加入到0.5ml活化的荧光微球溶液中，室温混匀2h，20000rpm离心15min，弃上清，沉淀用含1%酪蛋白的50mM甘氨酸溶液封闭，放置于摇床200rpm，摇匀0.5小时，20000rpm离心15min，沉淀保存在PH8.0且含有1%BSA的50mM Tris缓冲液中，得到溶液为即为CRP荧光微球溶液；

步骤S10：将步骤S7、步骤S8与步骤S9所得到的荧光微球溶液分别按体积1：1：1进行混合；

步骤S11：结合垫的制备，将已经预处理好的玻璃纤维素膜作为结合垫，将步骤S10制备的荧光微球混合液按照2ul/cm喷涂在结合垫上，45摄氏度干燥6小时；

步骤S12：NC膜的制备，分别将人变性IgG、ASO和CRP抗体稀释到1mg/ml，以1.0ul/cm的喷量依次喷涂在NC膜上已划好分割线的不同区域形成RF检测线、ASO检测线和CRP检测线，划好线的NC膜放置在45℃烘箱中干燥6h；

步骤S13：将样品垫、喷好微球混合溶液的结合垫、划线后的NC膜和吸水垫依次搭接粘贴在PVC底板上，保持各片材接头处均有2.0mm的重合长度，最后经过裁剪并封装到卡壳中即得到风湿三项联合检测试纸条。

所述步骤S6所选用荧光微球的原浓度为10mg/ml；所述步骤S1至步骤S4中备用保存的温度均设定为4℃环境保存；所述步骤S13裁剪的试纸条尺寸具体为长6.0cm、宽3.5mm。

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。