扩增子高通量测序

        扩增子测序是指利用合适的通用引物扩增环境中微生物的16S rDNA/18S rDNA /ITS高变区或功能基因，通过高通量测序技术检测PCR产物的序列变异和丰度信息，分析该环境下的微生物群落的多样性和分布规律，以揭示环境样品中微生物的种类、相对丰度、进化关系等。

一、细菌—16S rDNA

        细菌核糖体RNA(rRNA)有三种类型：5S rRNA(120bp)、16S rRNA(约1540bp)和23S rRNA(约2900bp). 5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多(占细菌RNA总量的80%以上)，便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。

        16Sr DNA是原核生物基因组中编码核糖体16S rRNA分子的对应的DNA序列，包括保守区和高变区。通过对高变区的对比可以区分出不同的物种，计算它们之间的差异程度。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个区域，每个区域都能够在一定的程度上反映物种之间的差别，但是反映的程度不一。可以针对某一个或者两个连续的高变区进行测序，比对数据库进行物种甄别。其中，V3-V4区其特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。

 原核和真核核糖体的结构示意图

 细菌16S rDNA基因序列组成及引物选择图

二、真核生物—18S rDNA

        与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA(rRNA),包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。

        18S rDNA是真核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列，其中既有保守区，也有高变区(V1-V9,没有V6区)。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种及以上的分类标准。在真核生物（如植物、动物、真菌、原生植物、原生动物等）的分子生态研究中，V4区使用最多、数据库信息最全、分类效果最好，是18S rRNA基因分析注释的最佳选择。

细菌18S rDNA基因序列组成及引物选择图

三、真菌—ITS

        ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），在染色体上，它一般处于大小亚基核糖体RNA基因序列之间。在细菌和古菌中，ITS位于16S和23 S rRNA基因序列间。在真核生物中，有两个ITS片段，分别为ITS1和ITS2。ITS1位于18S和5.8SrRNA基因间，而ITS2位于5.8S和25S（植物）或者28S（动物）rRNA基因间。真核生物中的ITS1跟细菌和古菌中的ITS是对应的。ITS2则起源于对其祖先23 S rRNA基因序列的插入。

        在真菌的分子生态研究中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。因此ITS区域是目前使用最多的测序目标区域，一般使用ITS2区域进行扩增，选取ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)作为扩增引物。

 ITS结构及引物示意图

四、功能基因

        所谓功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌、固氮菌等。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有相类似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如nosZ、pmoaA、dsrB、ureC、phoD、nxrA、nirS/nirK、amoA和nifH等。功能基因测序可有效研究特定环境中的功能微生物物种信息。

扩增子测序实验流程