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设计sanger测序引物，验证突变位点
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在进行Variation calling 分析之后的故事
在进行Variation calling 分析之后。首先需要进行过滤，一般基于frequency和function两方面进行突变的过滤。 frequency过滤：根据千人基因组测序项目的等位基因频率预测的0.5%作为阈值，小于这一值的认为是突变，因为千人基因组对于我们检测到的变异属于健康对照，若该变异在健康对照的频率过高，则是致病突变的可能性就比较低了。 function过滤：一般看exonic区的non-synonymous，frameshift deletion，frameshift insertion，nonframeshift deletion，nonframeshift insertion，nonsynonymous SNV，stopgain，synonymous SNV等。接着需要使用IGV查看变异位点的可靠性，并没有具体的标准。 一般先看看变异位点是否在reads的两端，若是，可能是接头没去干净； 其次看看具有该变异位点的reads占总reads的占比，一般保留>50%的； 最后看看变异位点两端是否”干净”; 另外，如果有家系的数据，可以对比着看看家庭其他成员在该位点是否有相同的变异，并推测可能的遗传方式。当然，以上方法得到的变异只能是初步的结果，还必须通过一代测序进行突变真实性的验证，今天的正题就是如何设计sanger测序引物？ 获取指定区域DNA序列网址：超链接 贴入位点，如chr7:74009352-74009352 先在UCSC中输入位点前500，后500个碱基， 点击get DNA ,复制结果
网址：超链接
PCR product size 取300-500之间主要因为节省测序成本，同时，如果设计的引物没有中点在500附近的，主要可以通过调整PCR product size的上限，这样获得的产物长点就长点吧！
Get primers NCBI的Primer Blast 中这里选择的Genome(reference assembly from selected organisms)实际上是GRCh38版本。细心的可能注意到了，第一步获取序列用的是hg19版本的，但没关系，还有第三步UCSC In-Silico PCR验证呢！这一步选择的是hg19版本，这一步会进行blast!所以primer blast 和另两步的版本不同对结果不会有影响。
点击submit，之后比较慢，等等吧！（同时完成引物的设计和blast，主要是blast比较耗时！）
一般第一条结果比较好，但是如果给出的若干个引物中有一条的中心更趋近与500处（待检测位点位于中间有利于测序，因为一般测序结果两端50bp会出现杂峰），则最好选择这一条，翻查下面对应的引物的正反向序列。 UCSC In-Silico PCR验证引物网址： https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?hgsid=603243225_C0DlViEzt0mvZEqK0DLtJx4pfsRN UCSC的PCR选项为电子PCR，输入引物（>15bp），即可得到两引物间序列。UCSC是基于基因组而非转录组，如果两引物间隔很大，则先调节Max Product Size。UCSC自动预测的TM值是基于primer3的，跟我们用的DNAman算出来的值也比较接近，PCR时可直接使用其退火温度。 用法：打开UCSC中的in silicon PCR，将上下游引物分别输入，可以选择物种，基因组，产物长度等，submit即可
Submit后，如果结果只对应处一条染色体上的一个位点，且primer melting温度控制在2度左右差范围即可，如下
整理结果：
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