不同粪便DNA提取方法比较分析

随着现代分子技术不断发展，测序成本下降，越来越多研究聚焦于人体肠道微生物与疾病的关系。大量研究表明，不同个体的肠道菌群结构、肠道微生物多样性，与炎症性肠病[1-4]以及肥胖等代谢性疾病的发生、发展密切相关[5-8]。因此，揭示肠道微生物群落结构与宿主健康间的关系，有助于为相关疾病的治疗提供思路[9-11]。目前，肠道菌群的研究主要依赖于测序技术，与传统培养方法相比，该方法更便捷和高效。但测序技术所依赖的实验过程，例如：样本采集后的保存、DNA提取、文库构建等过程，均有可能对最终群落结构的分析结果产生影响[12-14]。其中，DNA提取是关键环节之一，该过程所得微生物基因组DNA的纯度以及对原始肠道菌群组成比例的还原能力，将直接影响下游测序数据质量和肠道群落结构多样性结果[15-16]。因此，评估不同DNA提取方法对肠道特定种属的提取效果，对于全面、准确地获取人体肠道微生物谱，深入探究肠道微生物群落结构具有指导意义。

本研究旨在对5种基于离心柱法提取DNA的试剂盒进行比较，借助qPCR技术，以DNA提取纯度、浓度，以及对肠道中特定种属微生物基因组DNA的提取丰度为指标，综合评估5种DNA提取方法的效果，推测不同DNA提取方法对肠道微生物谱分析的影响，以期为后续相关实验中DNA提取方法的选择提供参考依据。

健康个体的粪便样本。

组织研磨仪、涡旋振荡器、金属浴恒温器、低温高速离心机、Qubit荧光定量仪、ABI7500实时荧光定量PCR仪和Bio Tek Epoch全波长酶标仪。其中，实验过程中DNA提取所用试剂盒信息如表 1所示。

如图 1所示，本研究利用粪便采集管，收集5名健康个体的粪便样本，分装后及时保存于–80 ℃冰箱。取健康志愿者的粪便样本250 mg，分别利用表 1所示的5种DNA提取方法，对志愿者肠道微生物基因组进行提取。提取细胞内DNA的基本原理是利用DNA分子与细胞内其他组分(如：蛋白质、脂质、多糖等) 理化性质的差异，通过特定的物理或化学方法使不同组分得以分离。主要包括细胞裂解和纯化两大基本过程，即利用裂解液，使蛋白质变性，破坏细胞结构，再经过一系列纯化步骤，提取DNA，去除其他成分。根据纯化方式的不同，可将DNA提取方法分为多种类型，如目前常见的酚氯仿抽提法、盐析法、离心柱法和磁珠法等[17-19]。本研究旨在对5种基于离心柱法提取DNA的试剂盒进行比较，具体DNA提取操作步骤详见试剂盒说明书。

吸取2 μL提取所得DNA，用Bio Tek Epoch全波长酶标仪测定不同试剂盒提取所得基因组DNA的浓度和A260/A280，初步检测不同DNA提取方法的效果。随后用Qubit® dsDNA HS Assay Kit和Qubit荧光定量仪对提取得到的DNA浓度进行精准定量。

将DNA样本与所需试剂置于冰上融化并混匀，按表 2所示比例进行混合，将适当体积的主混合物、DNA模板和引物加入到qPCR板的每个反应孔中，短暂离心，放入ABI 7 500实时荧光定量PCR仪中进行定量检测。实时荧光定量PCR主要通过向扩增体系中加入特异性的荧光基团，根据特定阶段荧光阈值与起始DNA模板拷贝数的线性关系，借助标准曲线，实现对起始DNA丰度的准确定量[20-21]。本研究中拟杆菌门微生物的定量检测使用染料法，其余微生物物种的定量均使用Taqman探针法，具体引物信息请见表 3。

应用5种DNA提取试剂盒分别对5名健康个体的粪便样本进行DNA提取，所得DNA的完整性结果如图 2所示，Q试剂盒和N试剂盒提取所得DNA的电泳条带单一、明亮，降解程度小，质量较高。PSP试剂盒提取所得DNA电泳条带弥散并伴有RNA污染。相比之下，M试剂盒和TG试剂盒提取所得DNA的电泳条带较暗，DNA浓度较低。

此外，以A260/A280比值为DNA纯度指标[22]，评估不同方法的提取效果。纯DNA样本A260/A280的比值为1.8，通常情况下，DNA A260/A280比值在1.8–2.0之间为佳。若比值低于1.6，表明提取所得DNA有蛋白质等污染，高于2.2则表明有较多RNA残留。如图 3B所示，试剂盒PSP、TG提取所得DNA A260/A280比值整体高于1.9，平均值分别为1.97和1.92，表明通过这两种试剂盒提取得到的DNA可能有RNA残留。而其余3种试剂盒Q、N和M提取所得DNA A260/A280比值均在1.8左右，平均值分别为1.83、1.84和1.82，表明该3种方法所得DNA纯度较高。

与传统紫外分光光度计测定DNA浓度相比，利用特异性和高灵敏度的荧光探针能够实现对DNA分子的准确定量。图 3A为5种方法提取所得DNA经Qubit荧光定量仪测定后的提取浓度。经克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test) 可知，不同提取方法所得DNA浓度差异显著(P < 0.05)。其中，Q试剂盒提取所得DNA浓度最高，平均为134.62 ng/μL。N试剂盒次之，平均浓度为56 ng/μL。PSP试剂盒提取所得DNA平均浓度位居第三，为53.78 ng/μL，但由于其存在一定的RNA残留(图 3B)，因此该结果可能高于实际浓度。与其他3种试剂盒相比，M和TG试剂盒提取所得DNA浓度最低，平均浓度分别为13.76 ng/μL和9.89 ng/μL，与图 2较暗的电泳条带结果一致。

对于特定肠道微生物基因组的提取，不同试剂盒的提取效果存在差异。本研究选取了7种常见人体肠道微生物，分别为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、白色念珠菌(Candida albicans) 和大肠杆菌(Escherichia coli)，利用实时荧光定量PCR技术，通过设计种属特异性的探针来准确定量提取所得指定微生物的丰度，评估不同试剂盒，对指定肠道微生物基因组的提取效果，以推测不同DNA提取方法对肠道群落结构分析的影响。如图 4所示，是不同提取方法对5名健康个体指定肠道微生物提取平均丰度的比较结果。纵轴代表 1 μL提取所得DNA中指定微生物16S rRNA基因的拷贝数(为了方便展示，为原始数据取对数后的数值)。

对于粪便样本中总16S rRNA基因即总菌(total) 的提取效果，如图 4A所示，Q试剂盒提取所得丰度最高，平均为1.70×109 copies/μL。N试剂盒提取所得总菌丰度位居第二，为1.02×109 copies/μL。而其他3种试剂盒提取所得总菌丰度相对较低，M试剂盒：4.22×108 copies/μL、PSP试剂盒：3.08×108 copies/μL、TG试剂盒：1.64×108 copies/μL。

相比之下，对于双歧杆菌属、乳杆菌属等革兰氏阳性菌基因组的提取，试剂盒Q具有更好的提取效果，N试剂盒次之(图 4B，4C)。以双歧杆菌为例，Q试剂盒提取所得平均拷贝数为1.15×107 copies/μL，N试剂盒的提取丰度平均为1.20×106 copies/μL。而试剂盒PSP、TG和M，提取所得平均丰度较低，分别为1.35×105 copies/μL、1.15×105 copies/μL和2.58×104 copies/μL。

对于拟杆菌门微生物基因组的提取(图 4F)，M、N、Q试剂盒提取所得拷贝数，显著高于PSP、TG试剂盒。同时，对于肠道白色念珠菌的提取(图 4G)，PSP、TG试剂盒所得拷贝数也显著低于其他3种方法。值得注意的是，就肠道普拉梭菌、阿克曼氏菌和大肠杆菌的提取丰度而言，不同方法间差异不显著(P > 0.05)。

对于肠道内特定微生物，如普拉梭菌、阿克曼氏菌和大肠杆菌的提取，不同方法间差异不显著。但对于具有特殊细胞壁结构的革兰氏阳性菌而言，不同方法的提取效果差异显著。提取过程中的裂解步骤可能是导致这种差异的主要原因之一。除裂解液组分的影响外，机械振荡研磨有助于获得更多样的微生物群落结构[23]。同时，Santiago等[24]研究发现，研磨珠机械振荡可提高群落中Blautia、Bifidobacterium等革兰氏阳性菌的丰度，与未经研磨珠机械振荡的对照组相比，二者间的群落结构存在明显差异。因此，不同DNA提取方法对肠道中特定菌种提取效果的差异，是影响肠道微生物谱分析结果的重要原因之一。

本研究比较了5种DNA提取方法在提取质量、DNA浓度以及所得细菌丰度方面的差别。其中，应用较为广泛的Q试剂盒，其提取效果最佳，平均浓度为134.62 ng/μL，所得DNA纯度较高，A260/A280比值平均为1.83。与Lim等[14]、吴仲文等[25]的研究结果一致，Q方法对革兰氏阳性菌如双歧杆菌有较好的提取效果，是获取高质量基因组DNA的有效方法。N试剂盒成本较低，其平均DNA提取浓度较Q试剂盒低，但在纯度方面，二者无显著性差异。与其他3种商用试剂盒(M、PSP、TG) 相比，N方法对肠道内指定微生物基因组的提取效果仅次于Q试剂盒，位居第二。相比之下，M试剂盒提取所得DNA，质量较高，但浓度偏低，对于肠道内革兰氏阳性菌的提取效果不很理想。而试剂盒TG和PSP提取所得DNA，在浓度、质量以及细菌丰度方面均不及其他验证的试剂盒。此外，在Lim等[23]的研究中，Q试剂盒提取所得肠道微生物群落的α多样性显著高于M试剂盒。

综上所述，Q试剂盒可作为肠道微生态研究相关实验中获取高质量基因组DNA的方法，但根据不同的实验要求与目的，可选择不同的提取方法。