避开这些问题，CRISPR基因编辑实验也没那么难做

4、riboEDIT CRISPR-Cas9体系常见FAQ？

Q1：riboEDIT CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势？

1. riboEDIT CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言，Cas9蛋白为瞬时表达，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。

2. 即用型体系，通过一步转染，5-6个工作日即可完成编辑效率检测，操作简便，显著缩短实验周期。

3. 不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。

4. 在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

Q2：使用riboEDIT Cas9 mRNA进行细胞基因编辑，如何确定细胞的转染效率？

高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件，可通过转染EGFP mRNA （货号：C11061-1）或其它荧光蛋白mRNA 来确定细胞的转染效率。riboFECT mRNA Transfection Reagent 转染试剂可实现各种细胞类型，包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染，从而提高Cas9 蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞，推荐使用电转、显微注射等方式，具体实验条件需要自行优化。

Q3：riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射？

可以，riboEDIT Cas9 mRNA 浓度为0.5μg/μL，建议显微注射前调整浓度到20-200ng/μL 范围，并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。

Q4：如何快速确定crRNA的有效性？

crRNA/tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关，不同的crRNA剪切活性不同，推荐通过体外酶切实验，在体外酶切靶DNA片段，快速筛选有效的crRNA，获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

Q5：riboEDIT CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么？

riboEDIT Cas9 mRNA和riboEDIT Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9，识别PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。

Q6：riboEDIT Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率？

从crRNA的设计角度，使用更严格的序列比对分析，建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。

Q7：T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因？

可能原因如下：

1. 细胞转染效率低，建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。

2. Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通过设置阳性对照组（riboEDIT Positive Control crRNA #1，货号crRP0001VS）共转染排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。

3. 在细胞内，Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点，建议重新设计crRNA。

4. 没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

Q8：琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多，无法分析剪切效率怎么办？

可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时，需重新设计引物，或通过优化PCR条件，来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR，提高扩增片段的特异性。

Q9：T7E1 突变检测时，出现条带弥散的现象，应该如何解决？

由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力，所以遇到这种情况，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，减少酶切时间来降低非特异切割现象。

Q10：对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞，应该选择哪一种riboEDIT CRIPSR-Cas9体系？

干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，转染试剂一般很难达到理想的转染效果，电转方式更适合这类细胞的转染，根据目前文献支持，Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率，对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT CRISPR/Cas9 RNP体系，具体实验条件需要自行优化。

Q11：riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多个靶点或基因的编辑？

可以，通过混合多条crRNA与tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共转染，可实现对多个靶点或基因的编辑，更佳共转染体系需自行优化，请保证crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

Q12：mRNA 转染与DNA 转染相比，有哪些优势？

1. DNA 转染需要进入细胞核，对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果，而mRNA 转染只需进入细胞质，可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。

2. 没有转录过程，蛋白表达更快速，缩短实验周期。

3. 更加安全，无DNA 整合风险。

Q13：如何用riboFECT mRNA Transfection Reagent 转染Cas9 mRNA 和sgRNA 进行基因编辑？

riboFECT mRNA Transfection Reagent 适用于转染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的双链DNA 或HDR 模板。尤其适用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共转染进行基因编辑， 转染步骤请参照《riboEDIT CRISPR-Cas9 体系使用说明》实验方法部分riboEDIT CRISPR/Cas9 mRNA 操作说明。当利用CRISPR 进行基因敲入，需自行优化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共转染体系，以获得效果。

Q14：转染过程中，细胞培养基内能否含有血清及双抗？

riboFECT mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的转染试剂，血清的存在会影响转染复合物的形成，请确保在孵育转染复合物时使用的是无血清培养基。孵育结束后，转染复合物可直接加入含有或不含有血清/双抗的细胞培养基中，无需更换培养基，操作简便。