黑色素瘤治疗临床动态2023：新型BET抑制剂联合舒尼替尼表现初步活性

　　根据发表在《实验与分子医学》上的一项临床前研究结果，舒尼替尼(Sutent)与BET抑制剂JQ1和NHWD-870在黑色素瘤细胞系中表现出协同活性。港安健康国际医疗指出，这项研究显示BET抑制剂可抑制BRD4/GDF15和BRD4/IL6/STAT3/GDF15途径，从而使黑色素瘤细胞系对舒尼替尼敏感。

　　为了确定FDA批准的药物库中哪些药物能与黑色素瘤中的BET抑制剂协同作用，研究人员在体外药物组合试验中筛选了240种抗肿瘤药物与JQ1组合。在A375和SK-MEL-28黑色素瘤细胞中，舒尼替尼和CDK4/6抑制剂都与JQ1有高度协同作用。

　　为了进一步确定舒尼替尼和JQ1的协同作用，研究人员在A375和SK-MEL-28细胞中进行了增加药物浓度的剂量反应实验。两个细胞系的组合指数值都小于1，表明药物的协同作用。在A375和SK-MEL-28细胞中也注意到舒尼替尼和NHWD-870(研究者开发的另一种BET抑制剂)之间的协同作用。研究人员还进行了菌落形成试验，以确定BET抑制剂加舒尼替尼的抗增殖作用，发现这些药物的联合治疗明显抑制了黑色素瘤细胞的增殖，进一步支持舒尼替尼和BET抑制剂之间协同作用的假设。

　　为了澄清这种协同作用是如何发生的，研究人员对用对照组、单独的JQ1、单独的舒尼替尼或JQ1加舒尼替尼处理24小时的A375黑色素瘤细胞进行了RNA测序分析。基因集富集分析显示，该组合对细胞周期进展的抑制作用明显高于其他组。该组合抑制了17个细胞周期相关的基因，包括调节细胞周期的CDK1和调节真核细胞DNA复制的CDC6。此外，港安健康国际医疗补充，流式细胞仪显示，BET抑制剂加舒尼替尼比单独使用BET抑制剂或舒尼替尼更能诱导G1停滞。

　　基因组变异分析显示，与每种药剂单独使用相比，该组合激活自噬和细胞凋亡途径更多。该组合的抗肿瘤作用被Z-VAD-FMK(一种细胞凋亡抑制剂)部分抑制，但不被铁蛋白酶、坏死酶或自噬酶抑制剂所抑制。Z-VAD-FMK也部分抑制了由JQ1和不同浓度的舒尼替尼诱导的A375细胞死亡。此外，BET抑制剂和舒尼替尼的组合比任何一种药剂单独使用都有更高的细胞凋亡比例，表明组合驱动黑色素瘤细胞的凋亡。

　　研究人员还分析了STAT3信号传导、细胞周期停滞和细胞凋亡的一部分与舒尼替尼敏感性之间的关联。发现STAT3信号传导在舒尼替尼的半数最大抑制浓度(IC50)较高的细胞中被明显激活。此外，GSEA显示STAT3抗性细胞有一个激活的IL6/JAK/STAT3通路。在生成的舒尼替尼耐药的黑色素瘤细胞中，STAT3的磷酸化也有所增加。在生成的STAT3敲除黑色素瘤细胞中，STAT3的抑制增强了舒尼替尼的敏感性。此外，STAT3抑制剂stattic使SK-MEL-28和A375细胞对舒尼替尼敏感。

　　当研究介导黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感性的STAT3磷酸化部位时，研究者异位表达野生型STAT3或STAT3磷酸化突变体。他们发现，共同表达野生型STAT3损害了shSTAT3诱导的黑色素瘤细胞敏感性，但STAT3磷酸化突变体却没有。这些发现表明，STAT3的抑制通过STAT3的磷酸化抑制，增强了黑色素瘤细胞对舒尼替尼的敏感性。

　　研究人员进一步分析了BET抑制剂通过抑制STAT3信号传导使黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感的能力。在JQ1处理的细胞中，JQ1抑制了c-Myc靶点表达。然而，在JQ1处理的细胞中，STAT3诱导下调的靶点被上调，表明JQ1抑制了IL6/STAT3信号传导活动。在用BET抑制剂处理的黑色素瘤细胞中，IL6的浓度也降低了，STAT3的磷酸化也是如此。

　　为了确定哪些BET蛋白有助于IL6/STAT3通路的信号传导，研究人员单独沉默了BRD2、BRD3和BRD4，结果显示，只有BRD4蛋白敲除明显降低了IL6浓度和STAT3磷酸化。港安健康国际医疗指出，进一步的BRD4沉默抑制了STAT3信号传导，并降低了IL6 mRNA水平。这些发现表明，BET抑制剂利用BRD4/IL6轴来抑制STAT3信号传导。

　　研究人员还通过用舒尼替尼或舒尼替尼加BET抑制剂孵化对照组和STAT3沉默的黑色素瘤细胞，评估STAT3信号是否介导BET抑制剂诱导的舒尼替尼细胞致敏。在BET抑制剂处理后，对照组细胞有明显的舒尼替尼致敏程度，但STAT3沉默的细胞则没有。Stattic使黑色素瘤细胞对舒尼替尼敏感，但在BET抑制剂存在的情况下，没有进一步增强这种敏感度。

　　当研究人员将BET抑制剂治疗和BRD4沉默后下调的基因重叠在一起时，他们发现了35个不同表达的基因。其中，GDF15和IL1A在对舒尼替尼有抵抗力的细胞中的mRNA水平明显增加，而在长期停用舒尼替尼后的mRNA水平则相当。GDF15的表达与舒尼替尼的logIC50呈正相关，但IL1A的表达则没有。实时聚合酶链反应(PCR)分析验证了BET抑制剂治疗降低了GDF15的mRNA水平，增加了舒尼替尼耐药细胞中GDF15的表达。

　　此外，GDF15敲除增加了细胞对舒尼替尼的敏感性，而GDF15过表达则降低了这种敏感性，这表明BET抑制剂通过抑制GDF15表达和STAT3活性来调节黑色素瘤细胞对舒尼替尼的敏感性。研究人员还发现，与对照组细胞相比，STAT3沉默的细胞减少了GDF15的表达，并且在stattic处理后GDF15b的表达进一步减少。一项ChIP-qPCR分析证实，在黑色素瘤细胞中，STAT3与GDF15启动子结合。

　　由于BET抑制剂对GDF15的抑制作用比stattic处理或STAT3沉默更强，研究者假设这种抑制作用除了BRD4/IL6/STAT3轴之外，还可能以另一种方式发生。当试图确定BRD4是否能直接调节GDF15的表达时，研究人员发现STAT沉默的细胞用BET抑制剂处理后确实有GDF15的表达减少。

　　为了评估舒尼替尼加BET抑制剂在黑色素瘤中的治疗潜力，研究人员通过将A375细胞接种到裸鼠的右腹，建立了皮下异种移植模型。当肿瘤体积达到50至100毫米3时，小鼠被随机分为舒尼替尼、NHWD-870或舒尼替尼加NHWD-870群组。所有的治疗都是连续2天，然后是1天不治疗。

　　与其他组相比，联合组的肿瘤重量和体积都有所下降，而小鼠的体重没有发生明显变化。对接受治疗的肿瘤进行的实时PCR分析表明，在NHWD-870和联合组群中，GDF15和IL6的mRNA表达减少，免疫组织化学(IHC)染色显示这些组群中GDF15、p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)的蛋白质水平下降。此外，Ki67的IHC染色显示组合队列中的增殖细胞较少，而TUNEL检测显示该队列中的凋亡细胞数量增加。这些发现表明BET抑制剂和舒尼替尼在诱导体内肿瘤抑制方面有协同作用。

　　港安健康温馨提示：这些发现表明，BET抑制剂介导的GDF15抑制在增强舒尼替尼在黑色素瘤中的敏感性方面起着关键作用，表明BET抑制剂在黑色素瘤中与舒尼替尼协同作用。期待这种疗法在未来的研究中获得更好的治疗数据，尽早获得批准上市，为患者带来更多希望。