【论肿道麻】肿瘤中CD8+T细胞分化和功能障碍

肿瘤内检测到癌细胞特异性的CD8+T细胞，然而，尽管它们存在，肿瘤仍有进展。免疫检查点阻断和过继T细胞治疗的临床成功证明了CD8+T细胞介导抗肿瘤反应的潜力；然而，大多数癌症患者无法获得免疫治疗的长期反应。2021年7月，Mary Philip等人在《Nat Rev Immunol》上发表了一篇题为《CD8+T cell differentiation and dysfunction in cancer》的综述，回顾了CD8+T细胞在肿瘤发生过程中向功能障碍状态的分化，强调了T细胞功能障碍和其他低反应性T细胞状态之间的异同，并讨论了导致肿瘤中T细胞状态异质性的时空因素。现简单介绍如下： 

CD8+T细胞具有选择性检测和根除癌细胞的能力。肿瘤表达抗原，包括肿瘤特异性的新抗原和自身抗原，在癌症患者中发现对这类抗原反应的CD8+T细胞。然而，尽管它们存在，即使是表达高免疫原性新抗原的肿瘤也常常进展。1968年Ingegerd和Karl Erik Hellstrom描述的、现在被称为“Hellstromm悖论”的生长中的肿瘤与T细胞共存，提示肿瘤反应性CD8+T细胞在肿瘤发生过程中功能失调。

对CD8+T细胞功能障碍的大部分认识来自于从已建立的、进展的肿瘤中分离出来的T细胞的研究:对肿瘤抗原反应的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)表达多种抑制受体(如PD1、LAG3、CTLA4和TIM3)，不能产生效应细胞因子(IFN-γ和TNF)或细胞毒性分子(如颗粒酶和穿孔素)。作者将癌症中的低反应T细胞称为“功能失调”，但其他几个术语也被广泛使用，包括“无能”、“耐受”和“衰竭”。后面几个术语最初被用来描述非肿瘤环境下的低反应T细胞状态，其中“无能”指在体内外没有共同刺激的情况下，启动或激活初始T细胞；“耐受”指具有自身抗原特异性的外周T细胞，因此，耐受的丧失导致自身免疫；“衰竭”指慢性感染时病原体特异性T细胞，其中衰减反应导致宿主-病原体相持而不引起有害的免疫病理。尽管功能失调的TILs与无能、耐受和/或衰竭的T细胞在表型、功能和分子上有相似之处，但这些状态之间存在重要的区别，本文将对此进行讨论。

低反应性CD8+T细胞状态

CD8+T细胞分化是一个严密调控的过程,与抗原相遇的性质、环境和持续时间的变化决定了CD8+T细胞分化的轨迹,导致T细胞状态从功能效应T细胞(例如，在急性感染、自身免疫或移植物抗宿主病中)到低反应性T细胞状态（例如，在肿瘤、慢性感染或自我耐受中）。当初始抗原特异性CD8+T细胞在急性炎症环境 (如病毒或细菌感染)中遇到抗原时，T细胞发生克隆性扩增，分化为溶细胞效应T细胞。病原体或抗原清除后，大多数效应T细胞死亡(收缩)，但有一小部分存活并形成持久记忆T细胞。随着T细胞从初始状态向效应和记忆状态分化，不同的转录和表观遗传程序定义了状态特异性的表型和功能特性。

耐受 “自我耐受”是指自身抗原反应性T细胞的低反应状态，是预防自身免疫所必需的。耐受通过中心耐受和外周耐受机制产生。在非活化和/或非专业的抗原呈递细胞(APCs )的非刺激环境中，正常组织中遇到自我抗原的初始、自我反应性T细胞不能接受充分的启动和激活信号，从而导致细胞凋亡或建立细胞内在的自我耐受方案。外周自我耐受的CD8+T细胞似乎有抗原经历，在T细胞受体( TCR )刺激下不能产生效应因子和/或增殖。

近几十年来，自身肿瘤抗原一直是免疫治疗的主要靶点，包括过继T细胞治疗。尽管在血液病恶性肿瘤和黑色素瘤中观察到了令人印象深刻的结果，但在其他实体肿瘤中靶向自身肿瘤抗原的成功有限。与自我反应性T细胞相比，新抗原特异性T细胞不受中央或外周自我耐受机制的阻碍，因此，理论上应表现出优越的抗肿瘤反应。然而，正如后面所讨论的，在肿瘤发展的早期阶段，新抗原可能呈现在非炎症的环境中，诱导一种类似于外周自我耐受诱导的低反应性T细胞状态。在进展期肿瘤中针对自身肿瘤抗原的T细胞表现出与新抗原特异性T细胞同样的功能障碍特征。自身肿瘤抗原特异性或新抗原特异性T细胞对免疫治疗干预的反应是否表现出功能上的差异，和/或某一临床反应是否主要由自身肿瘤抗原特异性或新抗原特异性T细胞驱动，目前在很大程度上未知。

无知 如果在免疫识别后的低水平或解剖部位表达的自身抗原，T细胞可以对其同源抗原“无知”，并保持在表型上没有抗原经历的初始状态。如果这些抗原在肿瘤发生过程中被癌细胞过度表达，这种无知是可以克服的。免疫无知并不局限于自身抗原，还可能影响肿瘤特异性新抗原。例如，在早期肿瘤发生过程中，转化细胞被包埋在正常组织或器官内，可以不被检测到(图1)。因此，肿瘤新抗原特异性T细胞可能保持无知，直到肿瘤进展到肿瘤抗原在TDLNs中呈现并激活抗原特异性T细胞。

无能 “无能”描述了T细胞在没有炎症和/或共刺激信号的情况下被激活时的低反应状态。适当的T细胞活化通常需要同时刺激TCR和共刺激受体，导致几个关键信号通路的激活和活化相关基因的诱导。在没有共刺激的情况下，TCR参与并不能有效激活这些通路，导致无能。在肿瘤细胞或APCs中遇到缺乏共刺激配体表达的抗原时，初始肿瘤特异性T细胞可被次优启动,因此“无能”也被用来描述肿瘤背景下T细胞的分化和功能障碍。T细胞无能和T细胞衰竭共享一些关键的分子特征;由于无能和衰竭是与肿瘤特异性T细胞分化和功能障碍最相关的低反应性T细胞状态，作者在这篇综述中重点关注这些转录回路。

衰竭 “衰竭”一词最初被用来描述慢性感染过程中低反应性T细胞状态。在慢性感染过程中，初始病原体特异性T细胞会扩张并初步分化为功能性效应T细胞。与急性感染（病原体被迅速清除，允许记忆T细胞形成）不同的是，在慢性感染时，消除性免疫无法实现，病原体持续存在，抗原特异性T细胞受到同源抗原的长期刺激。慢性抗原刺激导致效应器功能逐渐丧失，表现为良好的层次性，同时伴随着众多抑制性受体的上调，这种状态被描述为“衰竭”。T细胞衰竭不应被视为无反应的T细胞状态，而应被视为低反应性的适应状态:衰竭的T细胞在没有过多效应功能的情况下，使病原体得到控制，从而引起免疫病理。因此，T细胞衰竭是一种“有效的”低反应状态，它已经进化到允许宿主-病原体“相持”。当CD8+T细胞耗尽或出现免疫逃逸突变体后，病原体迅速扩张，证明衰竭T细胞发挥重要的免疫功能。晚期进展性肿瘤的T细胞由于不断遇到肿瘤抗原而变得低反应性，并且与慢性感染中的T细胞有许多共同的关键特征，因此“衰竭”被用来描述既定的、进展性肿瘤中的T细胞功能障碍。

肿瘤诱导的CD8+T细胞功能障碍

第一阶段:最初肿瘤抗原的出现与无知、无能或早期功能障碍有关 癌变发生有一系列的阶段——启动、促进和进展——通常是由正常细胞中的体细胞驱动突变启动的。在启动致癌攻击后，突变克隆逐渐积累额外的突变和表观遗传学改变，驱动克隆的扩展，加速生长和存活。在临床可检测到癌症之前，有一个很长的潜伏期。在肿瘤发生的早期阶段，也称“癌前期”或“早期恶性阶段”，突变可以产生新抗原，并且可以在转化细胞上呈现。一般来说，初始 CD8+T细胞不巡逻外周组织，而是在淋巴结和脾脏之间循环，最终在DCs上遇到抗原，这些抗原来自外周组织。在早期恶性阶段，当只有少数转化细胞时，抗原向DCs的释放极少。因此，肿瘤起始突变的最初感知主要落在组织免疫细胞上，如巨噬细胞、DCs、自然杀伤细胞和/或先天的类淋巴细胞。对小鼠模型的研究表明，经癌基因诱导的衰老处理的转化细胞可诱导先天免疫反应，这可以是肿瘤促进或抑制，取决于致癌基因、组织环境和特定模型。在肿瘤发生早期，肿瘤特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞反应的生产性启动需要足够的癌细胞死亡和/或APCs释放和摄取抗原进行抗原呈递，并适当激活APCs。在急性甚至慢性感染中，致病性抗原 “急性”出现，且呈高水平，导致由病原体相关分子模式(PAMP)激活的APCs进行抗原呈递，以及初始病原体特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞的最佳启动。这与肿瘤发生形成鲜明对比，在早期恶性阶段，肿瘤反应性CD8+T细胞可能仍然无知，直到有足够数量的癌细胞和肿瘤抗原形成并/或出现在TDLNs中。即使肿瘤抗原被APCs捕获并呈现，PAMP介导的先天免疫激活也不会发生，缺乏CD4+T细胞的帮助，导致T细胞启动不够理想，激活和分化为类似于无能和耐受的低反应状态。无知和早期诱导无能样T细胞低反应性可能解释了为什么即使是具有高免疫原性新表位的癌症也能够发展和进展(图1)。

第二阶段：持续性抗原和TCR刺激与晚期功能障碍相关 无知和早期T细胞低反应使早期恶性病变进展为完全确定的癌症，次级淋巴组织中抗原呈递增加和免疫细胞肿瘤浸润增加。随着癌症的进展和积累更多的突变，更多的肿瘤抗原被表达。在癌症体细胞进化树主干中产生的新抗原很可能在每个癌细胞上都有表达，而由驱动突变衍生的新抗原不太可能丢失。在肿瘤发生过程中稍后出现的突变抗原可能只在癌细胞的一个亚群上表达。非必要的乘客突变可能丢失，进一步导致抗原异质性。CD8+T细胞，特别是那些在所有癌细胞上表达的主干突变抗原特异性细胞，在肿瘤中会受到持续的抗原-TCR刺激，促进T细胞进入衰竭细胞状态。因此，肿瘤特异性T细胞分化分为两个阶段:在肿瘤发展的早期，T细胞在没有CD4+T细胞帮助的非炎症环境中遇到抗原后，进入无能的早期功能失调状态(阶段1)。这种低反应状态允许癌细胞生长。随着癌症的进展，T细胞不断受到肿瘤抗原的刺激，进入晚期功能失调状态(阶段2)(图1) 

图1 癌变与肿瘤特异性CD8+T细胞分化：两阶段分化方案

癌症中T细胞功能障碍的方案

在本节中，作者重点研究了T细胞分化和功能障碍的关键上游转录调控因子，指出在功能效应T细胞分化过程中，几个关键的T细胞功能障碍的转录调控因子也起着关键作用。

肿瘤发生过程中动态的T细胞分化方案 在原位肿瘤模型中，肿瘤发生的整个过程中CD8+T细胞群的克隆显示，肿瘤特异性T细胞快速分化到低反应状态，而似乎没有经过一个功能效应期(图2)。T细胞在进展的肿瘤中分化为更深的低反应状态。早期和晚期功能失调的肿瘤特异性T细胞的细胞毒性能力均受损，早期功能失调的T细胞可在从肿瘤中移除后恢复效应功能，而晚期功能失调的T细胞则不能被挽救。早期和晚期功能失调的肿瘤特异性T细胞可以通过表面蛋白表达来区分;尽管PD1和LAG3在早期和晚期功能失调T细胞上都有表达，但晚期功能失调T细胞表达额外的抑制受体，如CD38, CD39, CD101和TIM3。因此，肿瘤内的T细胞分化是渐进的，存在明显的T细胞功能障碍状态。事实上，不同的染色质可及性模式与早期和晚期功能障碍有关，两者都与功能性初始、效应和记忆CD8+T细胞的染色质可及性模式不同。来自黑色素瘤和肺肿瘤的人PD1+TILs与来自小鼠肿瘤的晚期功能障碍肿瘤特异性T细胞共享染色质可及性模式，这表明肿瘤内的TILs可能无法通过免疫治疗方法(如ICB)重新编程。表观遗传程序和T细胞功能障碍的状态已在其他小鼠肿瘤模型中得到证实。有趣的是，在一组接受ICB治疗的黑色素瘤患者中，发现了两种截然不同的CD8+T细胞状态，并与肿瘤消退或进展相关。

早期功能障碍分子程序 为了有效激活CD8+T细胞，TCR和CD28的共连接导致MAPK，JNK，PI3K-AKT和IKK信号通路的激活和细胞内钙的动员，随后激活多种转录因子，包括活化T细胞核因子(NFAT)和FOS-JUN二聚体(AP-1)。胞质NFAT由钙调蛋白依赖性磷酸酶calcineurin去磷酸化并易位到细胞核，在那里它与AP-1合作诱导与效应功能相关的转录程序。在没有共刺激的情况下，TCR参与导致MAPK、PI3K-AKT和IKK通路激活不佳， 从而使AP-1活性不足。使用无法与AP-1相互作用的结构活跃的NFAT突变体，Rao和同事证明，在没有AP-1合作的情况下，激活的NFAT会诱导不同于功能效应因子分化过程中触发的转录程序。以抑制性转录因子(EGR2, EGR3, IKZF2, IRF4和TOX)和其他负性调节蛋白(CBL-B)为特征。综合转录和表观遗传学分析发现，NFAT与单体结合位点的结合主要发生在无能相关基因的启动子和调控元件中，而复合NFAT-AP1结合元件存在于效应基因的启动子和调控元件中。因此，与活性AP-1合作的NFAT促进T细胞活化和效应子分化，而无伙伴NFAT促进无能。事实上，染色质可及性分析发现，在功能障碍的肿瘤特异性CD8+T细胞中，含有NFAT结合基序的位点明显比功能效应CD8+T细胞中更开放。

晚期功能障碍分子程序 慢性病毒感染的几项研究发现，两组病毒特异性CD8+T细胞：TCF1+CD8+T细胞具有记忆/干细胞样表型，自我更新并产生终末分化的TCF1lowT细胞。这两个群体在空间上是隔离的,TCF1+T祖细胞群体位于次级淋巴组织的T细胞区,而末端分化,衰竭的TCF1lowT细胞群主要存在于外周组织和脾红髓（感染细胞和/或抗原的储库）中。祖细胞衰竭T细胞和终末衰竭T细胞代表两种不同的T细胞状态或具有与重编程性相关的不同表观遗传程序的群体: 祖细胞衰竭T细胞可以通过ICB重新激活，而终末衰竭T细胞不能。

尽管肿瘤浸润性T细胞最初表达TCF1，但随后会下调TCF1，并且肿瘤内大多数肿瘤反应性功能障碍T细胞是TCF1low细胞，在慢性病毒感染期间，组织浸润性终末衰竭CD8+T细胞也是如此。因此，组织驻留似乎与TCF1表达的丧失相关。鉴于在慢性病毒感染期间维持衰竭的T细胞群，需要祖细胞样病毒特异性T细胞亚群中的TCF1表达，肿瘤免疫学家面临的一个重要问题是如何维持肿瘤特异性T细胞群。在慢性病毒感染中，有分支分化的证据，即淋巴组织中的祖细胞样T细胞既自我更新，又产生更多终末分化衰竭T细胞。正如急性感染所显示的那样，这种分支分化可能是由不对称细胞分裂驱动的。然而，在小鼠或人类肿瘤中仍然缺乏稳定的肿瘤反应性TCF1+祖细胞群体的证据，相反，纵向TIL数据可能支持线性分化模型，即TCF1+早期功能障碍TILs分化为TCF1low晚期功能障碍TILs。

在过去的2年里，另一种高迁移率组盒DNA结合蛋白，TOX，已经成为肿瘤和慢性感染中T细胞功能障碍项目的重要调控因子。TOX被认为以序列独立但结构依赖的方式结合DNA，并通过其反式激活域促进蛋白质辅因子的结合。近年来，TOX已被证明在感染、肿瘤发生和自身免疫过程中的外周CD8+T细胞分化中发挥重要作用。肿瘤小鼠模型表明，由NFAT调节的TOX在功能失调的肿瘤特异性T细胞中高表达，是由TCR刺激驱动的。TOX在人TILs中表达，其表达与抑制性受体表达呈正相关，与TCF1表达呈负相关. 

图2 慢性感染期间的衰竭及肿瘤中CD8 + T细胞分化和功能障碍模型

在小鼠肿瘤模型中，肿瘤中TOX缺陷的肿瘤特异性T细胞不再上调抑制性受体表达，但仍然保持完全低反应。因此，尽管TOX和抑制性受体表达和功能低反应之间存在关联，但T细胞功能或功能障碍与T细胞表型并非完全共同调节(图3)。因此，TOX和/或抑制受体并不只与低反应的CD8+T细胞状态相关。虽然PD1、LAG3、CTLA4、CD39、TIGIT等分子常被认为是衰竭标记物，但它们也可以被认为是激活标记物，因为它们也在初始T细胞激活后24-48h瞬时表达。在这种情况下，抑制性受体作为一种生理负反馈机制，防止活化的抗原特异性CD8+T细胞受到过度刺激。事实上，缺乏抑制性受体表达的TOX缺陷CD8+T细胞在慢性抗原刺激（如慢性感染和癌症）中无法持续存在，这表明TOX诱导的衰竭表型可以保护T细胞免受过度刺激（图3）。在原位肿瘤模型中，TOX缺陷肿瘤特异性CD8+T细胞没有显示出增强的效应功能，并保持低反应，而在慢性感染模型中，TOX缺陷祖细胞衰竭T细胞有增强的效应功能，在移植肿瘤模型中，TOX表达水平降低的肿瘤反应效应T细胞的抗肿瘤活性增加。因此，TOX在效应T细胞、祖细胞衰竭、无能、终末衰竭和功能失调的T细胞中发挥着不同的作用，TOX表达水平可能是决定命运和功能的关键。 

图3 肿瘤特异性T细胞功能障碍编程的两个模块：效应器功能丧失和衰竭表型

效应器功能丧失的机制 CD8+T细胞无法消除癌症有几种机制。这些机制包括T细胞外在机制:癌细胞介导的机制和TME介导的机制。抗肿瘤T细胞反应的缺乏也可能是由T细胞内在细胞毒性损伤(T细胞功能障碍)引起。细胞毒性CD8+T细胞通过多种途径清除靶细胞，包括细胞因子释放，颗粒胞吐作用和颗粒相关酶，或死亡受体-配体结合。除了这些直接的细胞毒性机制外，肿瘤反应性T细胞还可以通过靶向肿瘤基质细胞或肿瘤脉管系统间接诱导癌细胞死亡。肿瘤反应性T细胞杀死肿瘤的方式取决于肿瘤、环境和模型。

组织驻留程序 肿瘤中的T细胞具有与组织驻留相关的分子程序。组织驻留记忆T细胞在感染期间发育和播种组织，其特征是下调鞘氨醇1-磷酸受体1，组织保留标志物CD69、CD49a和CD103的表达，各种抑制受体(PD1、TIGIT和TIM3)和转录因子如HOBIT、BLIMP1和RUNX3的表达。除血液癌外，大多数癌症发生于非淋巴外周组织。T细胞迁移并浸润肿瘤组织，而TILs表现出组织驻留的特征，包括组织保留标志物CD103和抑制性受体的表达。CD103+CD8+TILs的存在与生存率的提高有关，与总CD8+TILs相比，CD103+CD8+双阳性TILs被确定是更好的预后标志物，并与接受ICB治疗的黑色素瘤患者生存率的提高有关。由于目前的数据在很大程度上仍然是相关的，因此需要进一步的研究来确定组织驻留TILs在人类肿瘤中的特异性和潜在的功能作用。

“论肿道麻”述评

癌症免疫疗法，包括ICB、疫苗、过继T细胞疗法和嵌合抗原受体T细胞疗法，已经引起了相当大的兴奋，在一部分患者和癌症类型中诱导持久的缓解，但大多数患者仍未能获得长期的反应。尽管付出了很多努力，目前仍无法预测哪些患者会有反应，也不了解决定成败的机制。最近的技术进步为CD8+TILs的异质性提供了重要的见解，表明不同的T细胞亚群存在着不同的转录和表观遗传程序，功能状态，以及对治疗性重编程的不同反应。然而，重要的问题和挑战仍然存在。

CD8+T细胞清除肿瘤的方式多种多样，可以直接靶向肿瘤细胞，也可以间接靶向肿瘤基质细胞。目前几乎不知道哪个或哪些机制与人类癌症最相关，不同的肿瘤和T细胞是否使用不同的机制，以及这些机制是如何在低反应性TILs中被颠覆的。细胞因子或细胞毒效应分子在转录后水平受到高度调控；因此，在利用人TIL转录数据来推断原位T细胞的功能状态时必须慎重。识别患者体内肿瘤反应性T细胞群及其功能状态，并理解这些T细胞如何执行抗肿瘤效应功能，将对理解和预测免疫治疗策略的疗效至关重要。今后必须继续开发和使用与临床相关的动物癌症模型以及人类样本，以获得机制上的见解，从而推动该领域的发展。

编译：张德海；述评：周国霞

审核：张军，缪长虹 

参考文献：   CD8   +   T cell differentiation and dysfunction in cancer. Philip M, Schietinger A. Nat Rev Immunol. 2021 Jul. doi: 10.1038/s41577-021-00574-3. Epub 2021 Jul 12.  

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