一种预防或治疗慢性疼痛的miRNA靶点及其应用

背景技术：

2.慢性疼痛(如三叉神经痛、坐骨神经痛、肿瘤疼痛、偏头痛等)是严重危害人类身心健康和生活质量的慢性疾病，被喻为“不死的癌症”，其反复发作、迁延难治的特征使患者长期遭受折磨，而且会诱发焦虑、抑郁和恐惧等恶性情绪或精神异常，甚至会引起个体产生自杀倾向，严重危害患者的生命及生活质量。流行病学数据显示，全球约五分之一人口患有慢性疼痛，且在老年群体中尤为严重。中国慢性疼痛患者已超过3亿人。在众多能缓解疼痛的制剂中，根据药理作用机制，主要可分为两类：阿片受体激动药及非甾体类抗炎镇痛药，但前者对慢性神经性痛疗效差，且患者长期使用后机体产生耐受及药物成瘾；而后者仅对轻中度疼痛有效，用药后可能会有心血管疾病和消化道出血等严重副作用。因此，寻求新的安全有效的止痛药物，且能避免成瘾依赖及严重副作用的新的镇痛药物制剂显得极为迫切。3.表观遗传学涉及基因表达或细胞表型的遗传性改变，却不改变潜在的dna序列，是组织炎症、损伤和疾病状态等不良因素刺激导致慢性疼痛形成的重要机制。微小rna(mirna)是内源性的长度约为22个核苷酸的单链非编码小rna。根据mirna前体两个臂(5’端臂和3’端臂)加工的不同，分别产生以“‑5p”和“‑3p”命名的有功能的成熟mirna。对于相似度较高，但又不完全相同(相差1-2个碱基)的成熟mirna，加上一个英文小写字母(a，b，c)以示区别。功能上，mirna广泛地参与到基因的转录后调节，在表观遗传调控中发挥着重要的作用。研究表明，mirna在慢性疼痛形成的过程中发挥着不可替代的作用，靶向mirna的药物已经在科研，甚至临床应用中得到重视。mir-203a-3p作为一类微小非编码rna，通过靶向沉默哺乳动物配对的mrna，主要参与了男性生殖系统发育、肝脏代谢及肿瘤发生。然而，mir-203a-3p是否在疼痛中具有作用，以及是否参与疼痛调节，目前仍未可知。

技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明以大鼠眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)诱导的三叉神经痛为疼痛模型，首先通过高通量全基因组测序，发现下丘脑弓状核(arcuate nucleus,arc)组织中有157个差异表达mirna(100个上调，57个下调)，筛选出arc中稳定高表达且差异表达上调的mirna，再应用种属间保守性筛选及实时定量pcr方法验证，在国内外首次发现了疼痛模型中差异性升高最为显著的mir-203a-3p，并发现arc核团定位注射mir-203a-3p的抑制剂可显著翻转模型大鼠痛敏反应。因此其可作为慢性疼痛新的治疗靶点，为慢性疼痛的治疗以及临床辅助诊断技术提供了新的方向。5.本发明的第一个目的是提供一种慢性疼痛靶点，所述靶点为mir-203a-3p。6.本发明的第二个目的是提供mir-203a-3p抑制剂在制备慢性疼痛治疗或预防药物中的应用。7.进一步地，所述mir-203a-3p抑制剂选自反义寡核苷酸、shrna、sirna等。其中，反义寡核苷酸靶向结合mir-203a-3p并阻断其对下游基因的靶向调节作用。8.进一步地，所述反义寡核苷酸为antagomir-203a。9.进一步地，所述antagomir-203a包含如下所示的核苷酸序列：5′‑cuagugguccuaaacauuucac-3′。10.进一步地，所述反义寡核苷酸包含一个或多个悬挂碱基tt。11.进一步地，所述悬挂碱基tt位于反义寡核苷酸的5′‑或3′‑末端。12.进一步地，所述mir-203a-3p抑制剂采用胆固醇、磷酸化、甲基化、假尿嘧啶化、聚乙二醇、巯基化中的一种或多种方式进行修饰。13.进一步地，所述慢性疼痛包括但不限于三叉神经痛、坐骨神经痛、神经病理性疼痛、偏头痛、肿瘤疼痛等。14.本发明的第二个目的是提供一种预防或治疗慢性疼痛的药物，该药物以mir-203a-3p为靶点进行设计，抑制mir-203a-3p的表达。15.进一步地，所述慢性疼痛治疗或预防药物由0.1-100％的mir-203a-3p抑制剂和99.9-0％的药用辅料组成。16.本发明的有益效果：17.本发明首先通过高通量基因测序技术，发现arc组织中表达丰度高、且差异性增高的mirna，通过种属保守性筛选及实时定量pcr方法进行验证，首次发现了在疼痛模型中特异性、差异性高表达的mir-203a-3p。行为学结果显示，注射以mir-203a-3p为靶点设计的药物可显著翻转慢性疼痛模型大鼠机械性痛敏反应。本发明发现mir-203a-3p高表达于慢性疼痛患者中，是独立的不利因素，因此mir-203a-3p可作为慢性疼痛相关的生物标志物，在慢性疼痛的预防、治疗、药物筛选等方面具有巨大的潜力。附图说明18.图1为眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型大鼠中mirna表达差异；其中，a为眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型大鼠机械性痛阈值图；b为高通量测序结果显示种属间保守、且cci-ion模型大鼠arc组织差异性高表达的mirnas；19.图2为cci-ion模型大鼠arc组织mir-203a-3p表达情况；其中，a为rt-pcr检测cci-ion模型大鼠arc及tg组织mir-203a-3p表达对比；b为荧光定量pcr检测cci-ion模型大鼠arc组织mir-203a-3p表达变化情况；c为荧光定量pcr检测cci-ion模型大鼠脑内不同核团内mir-203a-3p表达情况；20.图3为抑制arc内mir-203a-3p可显著翻转cci-ion模型大鼠机械性痛敏反应。a为arc内定位注射化学修饰的mir-203a-3p反义寡核苷酸antagomir-203a对cci-ion模型大鼠的疼痛治疗作用；b为预先注射mir-203a-3p慢病毒shrna干扰序列对cci-ion模型大鼠的疼痛预防作用；21.图4为正常大鼠arc内激活mir-203a-3p后的痛阈变化情况；其中，a为正常大鼠arc内定位注射慢病毒过表达mir-203a-3p基因后mir-203a-3p表达水平变化；b为正常大鼠arc定位注射慢病毒过表达mir-203a-3p后，给予antagomir-203a可显著翻转其诱导的大鼠机械痛敏反应；22.图5为arc内定位注射化学修饰的mir-203a-3p反义寡核苷酸antagomir-203a序列可显著翻转sni模型大鼠机械痛敏变化；其中，a为sni模型大鼠机械性痛阈值图；b动物行为学检测显示arc内定位注射antagomir-203a显著翻转sni模型大鼠机械性痛敏反应；23.图6为arc内定位注射化学修饰的mir-203a-3p反义寡核苷酸antagomir-203a序列可显著翻转偏头痛模型大鼠机械痛敏变化。具体实施方式24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。25.实施例1眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型大鼠中mirna表达差异26.1)眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型的建立27.采用成年雄性sprague-dawley(sd)大鼠，体重约为120克，由苏州大学实验动物中心提供，许可证编号为syxk(苏)2021-0074。饲养条件：5只/笼，自由摄食饮水，室温22-25℃，相对湿度50-60％，低噪音屏障环境，光/暗各12小时/天循环光照周期。实验动物需在标准环境中适应至少3天方可进行后续实验。腹腔注射4％水合氯醛对大鼠进行麻醉，待大鼠完全麻醉后将其仰卧固定，用无菌手术刀于左上颌第一磨牙处水平划开小口，用灭菌弯头镊钝性分离周围组织至清晰暴露眶下神经。三叉神经痛模型(cci-ion)组用医用缝合丝线分别在其两端进行结扎，避免用力过大，间距约为2毫米。随后，擦拭血迹并在伤口涂抹青霉素钠以防感染。假手术(sham)组在暴露眶下神经后，不进行结扎，并用相同的方法处理伤口。28.2)大鼠须垫部机械痛阈值的测定29.本实验在双盲的条件下进行，最小刺激强度从1克起，用von frey针刺激大鼠左侧须垫部。每次刺激使von frey针弯曲成90°，每次间隔5秒，至少连续刺激五次。当五次刺激中至少三次出现躲避、抓挠等行为时视为阳性反应(x)，此时降低刺激强度。否则记为阴性反应(o)，逐步增加刺激强度。从第一次出现阴性/阳性反应交替开始记录，随后再测量4次并记录。将6次的反应模式代入公式计算得到机械痛阈值。计算公式为：50％痛阈值(克)＝(10[xf+kδ])/10000。其中xf代表最后一次机械刺激的强度，k·δ代表不同反应模式所对应的系数。[0030]3)高通量mirna测序[0031]大鼠麻醉后断头置于冰上，暴露其脑组织，在解剖镜下利用维纳斯剪及显微解剖镊取完整的arc组织，尽量去除其血膜，并于预冷的无菌磷酸盐缓冲液(pbs)中漂洗去血液残留，立即置于1.5毫升灭菌离心管中，装在干冰中运输至公司。经过rna提取(qiagen rneasy试剂盒)、样品检测、文库构建、库检和上机illumina测序，最后进行生物信息分析，筛选cci-ion模型大鼠arc组织差异性表达的mirnas。测序过程由广州锐博生物技术有限公司完成。[0032]4)rna提取及实时荧光定量pcr[0033]应用qiagen rneasy试剂盒按步骤逐步实施，提取arc组织rna。使用5×primescript rt master mix将所提取的rna逆转录成cdna，具体参数为：逆转录温度为42度，15分钟；变性温度为85度，2分钟。随后进行pcr或荧光定量pcr检测，循环参数为：预变性温度为95度，15分钟；变性温度为94度，15秒；退火温度为60度，30秒；延伸温度为72度，30秒。循环次数为40次。实验结果以2-δδct进行计算。mir-203a-3p与内参u6的特异性引物由锐博生物公司合成，引物序列如下：rno-mir-203a-3p for rt：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctagtg；rno-mir-203a-3p，f：caccgtggtgaaatgtttagga；u6 for rt：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaata；u6，f：aga gaagattagcatggcccctg；all-mir-r：atccagtgcagggtcc gagg。trizol购自takara，逆转录试剂盒购自takara，sybr荧光染料购自bimake。[0034]如图1a所示，取sd大鼠20只，分为2组，每组10只。第一组为假手术组，第二组为cci-ion模型组。行为学结果表明，假手术组大鼠机械痛阈值在各时间节点都没有显著变化。cci-ion模型组大鼠从14天开始须垫部机械痛阈值显著降低，并可持续至28天(***p《0.001vs.假手术组)。如图1b所示，选取假手术组及cci-ion模型组第14天大鼠各24只，8只为一个样本，每组共3个样本，取其下丘脑弓状核(arc)组织进行高通量测序。筛选出cci-ion模型组大鼠arc组织表达丰度高、种属间完全保守、且差异性表达增高的mirnas共16个。荧光定量pcr结果显示，相对于假手术组大鼠，cci-ion模型组大鼠arc组织差异性表达的mirnas中mir-203a-3p升高最为显著(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.假手术组)。[0035]实施例2荧光定量pcr检测cci-ion模型大鼠arc组织mir-203a-3p表达显著升高，且有时程依赖性。[0036]1)眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型的建立(同实施例1)。[0037]2)rna提取及实时荧光定量pcr(同实施例1)。[0038]3)琼脂糖凝胶电泳：用tae配置2％琼脂糖凝胶，加热至完全溶解。静置一段时间后，加入ea50b red(1:10000)，摇匀后倒板待其凝固。每20微升产物加入4微升6×loading buffer，混匀后加入泳道内，最左侧泳道加入dna marker，恒压100v电泳35分钟。将琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪下显影，保存图像。[0039]如图2a所示，arc组织内的mir-203a-3p表达量约为三叉神经节的10倍(***p《0.001vs.三叉神经节，n＝3)。以相应未进行逆转录的rna样本作为阴性对照组。如图2b所示，选取假手术组及cci-ion模型组大鼠各4只，分别提取假手术组、cci-ion模型7天、14天、21天及28天大鼠arc组织rna。荧光定量pcr检测结果显示，与假手术组相比，cci-ion模型组14天后大鼠arc中mir-203a-3p表达显著升高，且可持续至术后第28天(***p《0.001vs.假手术组)。如图2c所示，正常大鼠4只，荧光定量pcr结果显示大鼠脑内不同区域mir-203a-3p表达存在差异。[0040]实施例3抑制arc内mir-203a-3p可显著翻转cci-ion模型大鼠机械性痛敏反应。[0041]1)眶下神经慢性压迫性损伤(cci-ion)模型建立(同实施例1)。[0042]2)大鼠须垫部机械痛阈值测定(同实施例1)。[0043]3)大鼠arc立体定位注射：将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，手术刀划开头皮，暴露颅骨bregma点及lambda点，用颅骨钻在两点中点水平偏右0.5毫米处钻一小孔。随后依据体重，用微量注射针在硬脑膜向下9.6-10.0毫米处进行注射，缓慢给药5分钟，给药结束留针10分钟后取出注射针。若大鼠在清醒后出现狂躁、抑郁等异常现象，将其剔除。注射mir-203a-3p拮抗剂antagomir-203a以及对照antagomir-nc(购自吉玛基因)，注射终浓度为1毫摩尔/升，每只大鼠注射1微升。[0044]如图3a所示，取正常大鼠32只，分为4组，每组8只。第一组为假手术组+注射antagomir-nc，第二组为假手术组+注射antagomir-203a，第三组为cci-ion模型组+注射antagomir-nc，第四组为cci-ion模型组+注射antagomir-203a。cci-ion模型组大鼠注射antagomir-203a后第2天，大鼠机械痛阈值显著回升(***p《0.001vs.假手术组+注射antagomir-nc；###p《0.001vs.cci-ion模型组+注射antagomir-nc)。表明arc内定位注射该拮抗剂antagomir-203a序列(5′‑cuagugguccuaaacauuucac-3′)可以显著缓解cci-ion模型诱导的大鼠疼痛行为反应，该antagomir-203a具有明显的镇痛作用。如图3b所示，为了阐明mir-203a-3p对疼痛的预防作用，我们预先注射慢病毒包装的mir-203a-3p干扰shrna(mir-203a-down，正义链序列5’‑ctagtggtcctaaacatttcac-3’，反义链5-gtgaaatgtttaggaccactag-3’)，3天后cci-ion造模，随后在第7、14、21天测痛。大鼠28只，分为4组，每组7只。第一组为注射mir-203a-nc组+假手术组，第二组为注射mir-203a-down组+假手术组，第三组为注射mir-203a-nc组+cci-ion模型组，第四组为注射mir-203a-down组+cci-ion模型组。cci-ion模型组后第14天大鼠注射mir-203a-down后机械痛阈值显著回升(***p《0.001vs.注射antagomir-nc对照+假手术组；###p《0.001vs.注射antagomir-nc对照+cci-ion模型组)。表明arc内定位注射antagomir-203a或mir-203a-3p干扰shrna可以显著缓解cci-ion模型诱导的大鼠疼痛行为反应，对疼痛具有治疗及预防作用。[0045]实施例4正常大鼠arc定位注射慢病毒过表达mir-203a-3p后，给予antagomir-203a可显著翻转其诱导的大鼠机械痛敏反应。[0046]1)大鼠须垫部机械痛阈值测定(同实施例1)。[0047]2)正常大鼠arc立体定位注射mir-203a-3p过表达慢病毒(mir-203a-up组)以及对照组(mir-203a-nc组，购自吉玛基因)，病毒滴度为1×109tu，每只大鼠注射1微升，5分钟注射完，留针10分钟。arc定位注射拮抗剂antagomir-203a(同实施例3)。[0048]如图4a所示，大鼠各组6只，分别提取arc组织。正常大鼠arc立体定位注射mir-203a-3p过表达慢病毒(mir-203a-up组)后，mir-203a-3p表达显著升高(***p《0.001vs.注射mir-203a-nc对照组)。如图4b所示，将32只大鼠分为4组，每组8只，分别为mir-203a-nc+antagomir-nc组，mir-203a-nc+antagomir-203a组，mir-203a-up+antagomir-nc组和mir-203a-up+antagomir-203a组，在注射mir-203a-nc或mir-203a-up后，第7天注射antagomir-203a。结果显示，arc内定位注射mir-203a-3p过表达慢病毒后大鼠机械痛阈值显著降低(第0天)，随后antagomir-203a注射后1天后大鼠机械痛阈值显著回升，并可以持续至注射后第5天(***p《0.001vs.mir-203a-nc对照组+antagomir-nc对照组；###p《0.001vs.mir-203a-up+antagomir-nc对照组)。以上结果表明，antagomir-203a序列(5’‑cuagugguccuaaacauuucac-3’)对三叉神经痛的镇痛作用是通过特异性靶向抑制mir-203a-3p而实现的。[0049]实施例5arc内定位注射化学修饰的mir-203a-3p反义寡核苷酸antagomir-203a序列可显著翻转sni模型大鼠机械痛敏变化[0050]1)大鼠sni模型的建立：采用经典的坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury,sni)，建立坐骨神经痛大鼠模型。坐骨神经通过股二头肌切开暴露。然后用5.0丝线结扎胫腓总神经，同时切断。手术结束时，用5.0丝线将肌肉和皮肤分成两层缝合，然后在伤口上涂抹利多卡因凝胶。对于假手术，以上述相同方式暴露坐骨神经，不结扎和切断神经。203a序列(5’‑cuagugguccuaaacauuucac-3’)对sni诱导的坐骨神经痛模型及偏头痛模型大鼠机械痛阈值的影响，发现arc定位注射antagomir-203a序列可以缓解上述模型大鼠诱导的大鼠疼痛行为反应，具有镇痛作用。[0061]本发明发现了antagomir-203a序列可通过靶向抑制mir-203a-3p的表达，显著翻转上述模型大鼠机械性痛敏反应，具有明显的镇痛作用。因此，该antagomir-203a序列还可应用在制备用于治疗或预防以mir-203a-3p为靶点的疾病药物中，所述疾病包括如三叉神经痛、神经病理性痛、偏头痛及肿瘤疼痛等。[0062]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。