如何开展CAGE和nanoCAGE[创新技巧]

CAGE的全称是cap analysis of gene expression，最早是由日本科学家Hayashizaki等发表在《PNAS》杂志上的。顾名思义，它是有关5’帽子的分析。CAGE是一种使用在分子生物学中的技术，能产生样品中mRNA的5’端快照。这种技术实现了高通量的基因表达分析以及转录起点的图谱分析。

很多方法都能确定转录本的丰度，包括RT-PCR、EST测序、SAGE和大规模平行测序等，这其中大部分都依赖3’端的序列。但是对于转录起点和相关启动子的鉴定，5’端特异的特征序列则是表达谱注释所必需的。因此，研究人员开始利用CAGE进行5’端短序列标签的克隆。

如何开展CAGE呢？《Nature Methods》上曾刊登过详细的实验步骤。1首先，逆转录并富集全长cDNA；然后在cDNA的5’端加上双链CAGE接头，以引入限制性内切酶MmeI的识别位点。在合成第二条链之后，用MmeI消化双链RNA，再与第二个接头XmaJI连接。之后进行PCR扩增，这样就产生了CAGE标签。纯化和浓缩后，即可进行高通量测序分析。

随后，研究人员利用这种技术产生了人和小鼠组织转录起点和启动子的第一张综合的单碱基分辨率图谱，并破译了人白血病细胞系THP-1的转录网络。

然而，在应用过程中，研究人员也发现了一些问题。CAGE需要大量的起始材料，大约50 μg总RNA，这就阻碍了一些样品量有限材料的转录组分析。为此，Hayashizaki等开发出一种小规模的CAGE，称为nanoCAGE 2，这种方法能够捕获低至10 ng总RNA的5’端转录本。

在2011年1月的《Cold Spring Harbor Protocols》上，Charles Plessy等发表了NanoCAGE的详细步骤。与标准方法不同，nanoCAGE采用了模板转换（template-switching）方法来捕获分子的5’端。操作流程如下图。

在第一链cDNA合成反应中加入模板转换寡核苷酸（TS Oligo）和逆转录引物。TS Oligo 3’端的3个鸟苷酸以帽依赖的方式与新合成cDNA链3’端的脱氧胞苷杂交。之后，逆转录酶利用TS Oligo作为模板，延伸cDNA链。因此，cDNA 3’端的序列与TS Oligo的序列反向互补。这些序列是合成和扩增第二条链所必需的。这篇操作步骤是可以免费查看的，详见参考文献3。

另外，研究人员还以CAGE为基础开发出了CAGEscan技术。它能够定位转录起点的RNA分子，是探索RNA世界的重要工具。关于CAGE相关技术的原理及成果，详见横滨理化研究所（RIKEN Yokohama Institute）的网页，地址为：http://www.osc.riken.jp/english/activity/cage/。（生物通 余亮）

参考文献：

1. Kodzius, R. et al. CAGE: cap analysis of gene expression. Nat Methods 3: 211-222.2. Plessy, C. et al. Linking promoters to functional transcripts in small samples with nanoCAGE and CAGEscan. Nat Methods 7: 528-534.3. Salimullah, M. et al. NanoCAGE: A High-Resolution Technique to Discover and Interrogate Cell Transcriptomes. Cold Spring Harb Protoc; 2011; doi:10.1101/pdb.prot5559