BMDC 分离实验方案

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分离

​! 在 1-6 步中，确保所有的试剂和样品都置于冰上，因为这对细胞活性有着积极影响。

! 为保持无菌状态，采用无菌器皿在超净工作台内执行所有步骤。观看无菌技术视频指南。

1.于小鼠髋关节上方切下后腿，露出股骨和胫骨，膝关节和踝关节保持不动，用 KimwipesTM 擦拭以除去肌肉和组织。

! 股骨的骨髓比胫骨多。

! 仅使用完整的骨头，因为骨髓被破坏后无法保证无菌。

2.在培养皿中注入 70% 乙醇，将干净的骨头在其中浸泡 5-10 秒以完成外部消毒。清洗所有骨头，并将其放入周围加冰的无菌管中。

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! 清洗骨头时，骨头可以在乙醇中放置更长时间，但要注意乙醇能渗入骨头并杀死活细胞。

3.在超净工作台内一律使用无菌器具，用剪刀在尽可能靠近关节处剪去骨头的两端。在注射器中注入预冷的 RPMI 完全培养基 (R10)，然后将注射器针头插入骨头，将骨髓冲出至周围加冰的离心管中。冲洗 2-3 次，直至骨头完全变白。用移液管吸打骨髓液几次，以分离所有的团块。

4.在 R10 培养基中于 1500 rpm 转速下离心 5 分钟（1-2 次）。

5.在 R10 培养基中重新悬浮细胞沉淀，并用血细胞计数器和台盼蓝对活细胞进行计数。

! 使用血细胞计数器进行活细胞计数的过程可参见我们的详细实验方案。

6.用 10 mL 的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF 稀释细胞，并以 2×106 活细胞/皿的密度接种到培养皿中。

7.将培养皿放入 5% CO2 的 37°C 培养箱中培养。

8.在第三天再加入 10 mL 的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF。

! 轻轻地添加培养基，以免干扰细胞生长。

9.在第六天移除一半的培养基 (10 mL)。

! 轻轻地移除培养基，以免干扰细胞生长。

10.简单地离心移除的培养基（因为 DC 为松散贴壁细胞，移除的培养基中可能含有），并将细胞沉淀重新悬浮于 10 mL 新鲜的 R10 + 20 ng/mL GM-CSF 中，然后添加回原来的培养皿中。

! 细胞可在第八天收获，如在第九天或第十天收获细胞，则重复第10步。

11.培养物上清液中的非贴壁细胞和松散贴壁细胞可用 PBS 轻轻冲洗收获，然后将其合并以进行后续实验。

! 大部分贴壁细胞为巨噬细胞，悬浮或松散贴壁细胞则是树突细胞 (DC) 和 F4/80+ 巨噬细胞。为获得高度纯化的组分，建议采取措施除去 F4/80+ 细胞并富集 CD11c+ 细胞群。

! 悬浮液中的大部分巨噬细胞均可同时表达 F4/80+ 和 CD11c。F4/80+ 细胞可以通过抗 F4/80 的磁珠阳性选择去除。完成该步骤后，CD11c+ DC 可通过加入抗 CD11c 的磁珠进行阳性选择获得。

! 此处避免使用 EDTA，因为 EDTA 可使贴壁的巨噬细胞悬浮，稀释 DC 样本。

12.未成熟的 DC 可以在纯化后立即使用，或者如果用户希望获得成熟的细胞也可以进一步培养。

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! DC 为松散贴壁细胞，仅附着于板即可成熟，因此可使用经非组织培养处理 的96 孔 U 型底微孔板以防止过早成熟。

纯度评估

建议取一份细胞进行流式细胞术实验以检查纯度。纯度检查试剂可用来标记仍附着于磁珠上的细胞。

推荐标记物

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我们邀请了第三方合作者 Karen Wozniak 博士（德州大学圣安东尼奥分校研究助理教授）来运行我们的 BMDC 分离培养实验方案。采用实验方案中提到的 Abcam 试剂，Wozniak 博士能够成功纯化未成熟的 DC 细胞群。下面列出了相关数据。

纯度评估

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经 GM-CSF 培养和阳性筛选纯化后，用流式细胞仪检测细胞纯度。对 CD45+ 细胞设门后，根据细胞群表达 CD11c 的比例确定纯度（图 1）。