BCA Protein Assay Kit (BCA蛋白浓度测定试剂盒)

2023-08-14 22:25| 来源: 网络整理| 查看: 265

A.试管配制

1.以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B. 即将50 ml BCA试剂A与1 ml BCA试剂B混合.注意: 使用以下公式确定所需工作试剂的总量. (标准品+待测样品) x (重复次数) x (每个样品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液总体积.2.按照表1配制新的标准品体系. (用0.9% NaCl或PBS稀释白蛋白 (BSA) 标准液)

表1：白蛋白(BSA)标准品的制备

Tube Number 稀释液体积 (μl) BSA体积 (μl) BSA终浓度 (μg/ml) A 0 μl 900 μl of 2 mg/ml Stock 2000 μg/ml B 100 μl 300 μl of tube A 1500 μg/ml C 300 μl 300 μl of tube A 1000 μg/ml D 200 μl 200 μl of tube B 750 μg/ml E 300 μl 300 μl of tube C 500 μg/ml F 300 μl 300 μl of tube E 250 μg/ml G 300 μl 300 μl of tube F 125 μg/ml H 400 μl 100 μl of tube G 25 μg/ml I 300 μl 0 0 (blank)

3.将0.1 ml的每种标准品和蛋白质样品加入单独的标记试管中.4.在每个试管中加入2 ml BCA工作试剂并充分混合.5.在37°C下孵育30分钟.注意：增加孵育时间和温度会增加每次测试的净562 nm吸光度, 并同时降低试剂盒的最低检测水平和测试范围.6.将所有管子冷却到室温(RT) .7.将分光光度计的波长设置为OD 562nm. 用水将仪器校准为零. 随后, 在10分钟内测量所有样品的吸光度.注意: 即使冷却至室温后, 色彩仍会继续显影. 但是, 如果所有吸光度测量均在10分钟内进行, 则随后在RT处的显影太弱而不会产生明显的误差.8.从所有读数中减去空白的OD562.9.绘制BSA标准曲线: OD562 (Y轴) vs BSA标准浓度 (X轴)。使用标准曲线确定每个待测样品的蛋白质浓度.

B. 微孔检测法

1.以50:1的比例混合BCA试剂A和BCA试剂B. 即将50 ml BCA试剂A与1 ml BCA试剂B混合.注意: 使用以下公式确定所需工作试剂的总量. (标准品+待测样品) x (重复次数) x (每个样品所需要的BCA工作液) =所需BCA工作液总体积.2.按照表2配制新的标准品体系. (用0.9% NaCl或PBS稀释白蛋白 (BSA) 标准液)

表2：白蛋白(BSA)标准品的制备

Tube Number 稀释液体积(μl) BSA体积 (μl) BSA终浓度 (μg/ml) A 0 μl 200 μl of 2 mg/ml Stock 2000 μg/ml B 30 μl 90 μl of tube A 1500 μg/ml C 60 μl 60 μl of tube A 1000 μg/ml D 60 μl 60 μl of tube B 750 μg/ml E 60 μl 60 μl of tube C 500 μg/ml F 60 μl 60 μl of tube E 250 μg/ml G 60 μl 60 μl of tube F 125 μg/ml H 100 μl 25 μl of tube G 25 μg/ml I 60 μl 0 0 (blank)

3.将25μl的每种标准品和蛋白质样品添加到单独的微孔板孔中。4.向每个孔中添加200μlBCA工作试剂并混合。5.密封板并在37°C下孵育30分钟。6.将板冷却至室温(RT).7.在10分钟内在读板器上测量562 nm的吸光度.8.从所有读数中减去空白的OD562. 绘制BSA标准曲线: OD562 (在Y轴上) 对BSA标准浓度 (在X轴上). 使用标准曲线确定每个待测样品的蛋白质浓度.

重要产品信息

1.如果将本试剂盒冷藏或存放在冷库中, 则试剂A或试剂B中可能会形成沉淀物. 要溶解沉淀物, 请在37°C下缓慢加热溶液, 同时进行混合或微波处理几秒钟. 如果试剂盒被细菌污染, 则将其丢弃.2.如果样品中仍然存在还原性物质或金属螯合物而引起干扰, 建议使用Bradford分析试剂盒.3.建议一式两份地测定不同浓度和样品的标准液. 每种测定均应绘制标准曲线. 4.彻底混合试剂A和试剂B后, 新形成的绿色浊度将消失. 它不会影响性能.5.使用分光光度计检测蛋白质浓度时, 测定的样品量将减少. 使用37°C的培养箱时, 请防止水蒸发的影响.6.消除或最小化干扰物质影响的几种方法:•通过透析或凝胶过滤去除干扰物质.•稀释样品，直到物质不再干扰为止.•由于高浓度的去污剂也会影响结果, 因此请用三氯乙酸 (TCA) 沉淀样品中的蛋白质.7，避免使用包括还原性物质, 螯合剂, 强酸和强碱在内的物质, 因为即使浓度很低也会干扰蛋白质的估算.

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