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今天又在做Western,准备蛋白样品的时候遇到一个问题,于是向老师请教,结果被骂得狗血淋头。* 被骂不要紧,今天终于发现了我在蛋白样本制备和保存中存在一个一贯错误。 我曾经拍过一集《实验员小哈&实验系列 - 第八集 - 贴壁活细胞全蛋白提取》(https://www.bilibili.com/video/BV11f4y1R7R4),视频中,蛋白提取完毕后,我按照1:4的体积比加入buffer对蛋白进行100度5min的煮样,然后-80度冻存,以备之后做western blot。 多少年了,我一直是这么做的,也没发生什么问题。 但是!今天我尝试从组织中提取蛋白,参考之前从细胞中提蛋白的方法,加了一个匀浆的步骤,一路做到离心、取上清、定量。至此,一切都很顺利,除了所得蛋白液不是无色的,略带一点黄褐色,让我有一丝丝担忧。但因为定量结果显示蛋白浓度很高(大于10mg/ml),我也就没有太在意。 加buffer,煮样,悲剧了。煮样5min以后,蛋白液不再是澄清的液体,蛋白凝固沉淀了。拿去问老师,被骂了。。。 先说蛋白为什么凝固沉淀了。因为我今天制备的样品,不但浓度高,体积也大,于是蛋白的总量很大。按之前较低量蛋白的算法,加入的buffer不够。 -- 那我可不可以多加一点呢? -- 不可以! -- 那现在怎么办呢? -- 扔掉,重新做! 正确的做法:蛋白提好了,定量做完了,就什么也不要干了!量大的话,分装冻起来,等到要做Western的时候,再取适量出来解冻、加buffer、煮样、Western。 -- 被骂了也不忘诡辩:以前从细胞里提蛋白,提不了多少,Western也不够做几次的,提前煮样冻起来,做Western的时候,就少了个步骤,能快一点做完下班。。。 祈祷下一轮组织蛋白的提取顺利~~ |
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