【生物信息笔记】fastq demultiplex（dry

参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/26506787

Illumina测序仪下机的数据通常为bcl格式，是将同一个测序通道（Lane）所有样品的数据混杂在一起。每个Lane里有n个样品的fastq.gz和一个undetermined.fastq.gz。区分每一样品的方法是根据不同的index。

Illumina官方出品的Bcl2FastQ软件，根据Index序列分割转换成每个样品的FastQ文件，打开长这样：

每一条read，包含四行，第一行read的ID，最后几个碱基序列是index；第二行是你的library里的DNA的序列（应该是不包括index和barcord primer 序列了）；第三行+／-应该代表正链反链（具体没什么意义）；第四行，每个碱基的测序质量。以上就是fastaq的嘴脸。

#常用软件#

我以前都是用cutadapt + FASTX-Toolkit的组合，直到同事们给我推荐了Trim Galore，质量评估使用FastQC。

BCL 格式文件是Illumina DNA sequencing instruments （HiSeq 或者 MiSeq） 创建的文件。BCL文件可以被CASAVA系统进行分析。也可以通过Illumina DNA sequencing instruments转化成QSEC格式文件。

Illumina Miseq的官方中文介绍

Miseq的Bcl文件位置在e.g.： /sequencedata/MiSeq/170808_M00528_0300_000000000-AP0TP/Data/Intensities/BaseCalls/L001/C1.1

我们的Miseq data是自动传入到服务器里的，我们连接到服务器后就可以进入到这个文件夹。

bcl2fastq2安装及其依赖gcc,boost,cmake等的安装

bcl2fastq2 Conversion v2.19 使用指导

bcl2fastq2 release NOTE 官网

KNOWN ISSUES:

Corrupted *.bcl or *.bcl.gz files may cause bcl2fastq to stall indefinitely.

No index sequences are included in the header for each read in the resulting FASTQ

files if bcl2fastq is run without providing a sample sheet file.

The HTML report files will not display statistics for samples and projects named“default”, “all”, “unknown”, and “undetermined”.

The HTML report, Stats.json, and ConversionStats.xml files incorrectly reports the

% ≥ 𝑄30metric by excluding bases with quality score 30 (i.e. the number reported is

actually % > Q30).

5’ adapter trimming is not supported.

“N” is incorrectly allowed as anindex sequence character in the sample sheet. When

used, this will cause a mismatch for any sequence character other than “N”.

No warnings or errors are displayed when bcl2fastq is used to process run folders

that are missing control files.

Sample sheet files generated from Illumina Experiment Manager may cause bcl2fastq

to abort if they contain non-ASCII characters. Only alphanumeric characters dashes,

and underscores are allowed in the sample sheet.

Illumina刚下机的数据为bcl格式文件（per-cycle BCL basecall file），但是下游的分析一般都需要fastq格式文件，所以在进行下游分析之前，需要使用CASAVA软件中的configureBclToFastq.pl将bcl格式的文件根据每个样本之前添加的index分出，并转为fastq格式的文件。在看bcl2fastq的说明文档时，会经常碰到一个词：demultiplexing，指的就是将multiplexed的reads根据index从不同或者同一个lane中分出，生成sample对应的fastq文件，这一步就涉及到输入正确的samplesheet.csv。

所有的步骤只使用一行代码就可以解决，首先贴出代码：

参考：chen_amiao的博客

以下参考：

bcl2fastq是illumina官方提供的bcl文件转化为fastq软件。

Google或官网搜索最新版，https://support.illumina.com/downloads/bcl2fastq-conversion-software-v217.html

下载

bcl2fastq2 Conversion Software v2.17 Installer (Linux tarball)  安装源文件

bcl2fastq2 Conversion Software v2.17 Guide (15051736 G)     介绍文件pdf

电脑Ubuntu14.04准备环境：

​To build bcl2fastq2 Conversion Software v2.17, you need the following software.Versions listed are tested and supported; newer versions are untested.

} gcc 4.7 (with support for c++11)

} boost 1.54 (with its dependencies)

} CMake 2.8.9

} zlib

} librt

} libpthread​​

系统：bio-linux8

1.更新软件（安装环境）​

sudo apt-get update

sudo apt-get upgrade

sudo apt-get install zlibc

sudo apt-get install libc6 # provides librt and libpthread

sudo apt-get install gcc

sudo apt-get install g++

sudo apt-get install libboost1.54-all-dev

sudo apt-get install cmake​​

#设置变量

export TMP=/tmpexport SOURCE=${TMP}/bcl2fastq

export BUILD=${TMP}/bcl2fastq2-v2.17.1.14-build

export INSTALL_DIR=/usr/local/bcl2fastq2-v2.17.1.14

cd ${TMP}​

#软件包放在 /home/me/下载/bcl2fastq2/

tar -xvzf /home/me/下载/bcl2fastq2/bcl2fastq2-v2.17.1.14.tar.gz

mkdir ${BUILD}

cd ${BUILD}

sudo ${SOURCE}/src/configure --prefix=${INSTALL_DIR}​

#上步显示成功，继续下面，未成功则可能是有些软件包没装好，重新更新下依赖环境

make

make install​

#################测试##################

/usr/local/bcl2fastq2-v2.17.1.14/bin/bcl2fastq -v

2.运行参数 -h​

/usr/local/bcl2fastq2-v2.17.1.14/bin/bcl2fastq -h ​

参考：http://nhoffman.github.io/borborygmi/compiling-bcl2fastq-on-ubuntu.html#sec-2

https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/software_documentation/bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-17-software-guide-15051736-g.pdf