微生物组间差异分析之LEfSe

LEfSe分析，可以分析组间菌群差异，找出各组间差异的微生物种类，有助于开发biomaker等研究，因此LEfSe分析在微生物相关文章中经常出现。我们今天来详细讲解一下LEfSe分析的原理及图表解读。

LEfSe分析原理

Step1. 首先在多组样本中采用 非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验 检测不同分组间丰度差异显著的物种；也就是图中按class1 和class2两个大的分组，每一行都进行检验，初步得到差异物种，通过检验的打钩进入step2检验；Step2. 再利用Wilcoxon秩和检验，对每一组中的亚组进行两两检验，具有显著差异的再进行下一轮检验。Step3. 最后用线性判别分析（LDA）对数据进行降维并评估差异显著的物种的影响力（即LDA score）。

前两步的Kruskal-Wallis秩和检验、Wilcoxon秩和检验 比较简单，类似T检验或者方差检验等，只不过T检验和方差分析为参数检验（要求数据符合方差齐性、正态分布），而在微生物多样性分析中，样品物种丰度分布不确定，多采用非参数检验，所以采用非参数的Kruskal-Wallis秩和检验、Wilcoxon秩和检验。比较复杂一点的就是最后的LDA分析。

LDA是一种监督学习的降维技术，也就是说其数据集中的每个样本是有类别输出的。是在目前机器学习、数据挖掘领域经典且热门的一个算法这点和PCA不同。PCA是不考虑样本类别输出的无监督降维技术。LDA是有监督的，所以LDA算法可以很好的利用样本的分组信息，得到的结果更可靠，这就是LDA分析优势。理解了LDA分析的原理，就不难理解LEfSe的分析结果了。

LDA分析原理：

LDA是一种经典的降维方法线性判别分析（Linear Discriminant Analysis）。LDA的思想可以用一句话概括，就是“投影后类内方差最小，类间方差最大”。什么意思呢？ 我们要将数据在低维度上进行投影，投影后希望每一种类别数据的投影点尽可能的接近，而不同类别的数据的类别中心之间的距离尽可能的大。

可能还是有点抽象，我们先看看最简单的情况。假设我们有两类数据 分别为红色和蓝色，如下图所示，这些数据特征是二维的，我们希望将这些数据投影到一维的一条直线，让每一种类别数据的投影点尽可能的接近，而红色和蓝色数据中心之间的距离尽可能的大。

上图中提供了两种投影方式，哪一种能更好的满足我们的标准呢？从直观上可以看出，右图要比左图的投影效果好。因为右图的黑色数据和蓝色数据各个较为集中，且类别之间的距离明显，而左图则在边界处数据混杂。以上就是LDA的主要思想了，当然在实际应用中，我们的数据是多个类别的，我们的原始数据一般也是超过二维的，投影后的也一般不是直线，而是一个低维的超平面。

LEfSe分析结果：LDA值分布柱状图：

图中展示了LDA Score大于设定值的物种(less_strict 设为2；more_strict 设为4)，即组间具有统计学差异的Biomarker。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的显著性（即为 LDA Score）。

进化分支图：

在进化分支图中，由内至外辐射的圆圈代表了由界(单个圆圈)至属（或种）的分类级别(不同的分类水平下圆圈的层数不同，下图为order水平下进化图，所以有4层)。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。着色原则：无显著差异的物种统一着色为黄色，差异物种 Biomarker跟随组进行着色，红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，其它圈颜色意义类同。图中英文字母表示的物种名称在右侧图例中进行展示。

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