第三代ALK抑制剂Lorlatinib（辉瑞）的发现

背景

间变性淋巴瘤激酶(ALK)是胰岛素受体家族的一种受体酪氨酸激酶，主要在成人脑组织中表达，在神经系统的发育和功能中起重要作用。

ALK最初被确定为融合蛋白NPM-ALK的一部分，该融合蛋白是由间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中染色体2和5之间的相互易位产生的。

随后，在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、炎性肌纤维母细胞瘤（IMTs）、非小细胞肺癌（NSCLC）中也发现了其他的ALK融合蛋白。

过去20年，超过20种ALK融合蛋白在各种癌症中被发现。2007年，EML4-ALK融合蛋白在3-7%的NSCLC患者中被发现，至此，医药领域充分认识到ALK作为肿瘤治疗靶点的潜在意义。

crizotinib是第一个被美国FDA批准的ALK阳性肺癌患者的一线治疗药物（2011）。crizotinib显示了可观的治疗效果，然而病人最终出现耐药性。患者肿瘤组织分析显示耐药性主要由于ALK基因发生了点突变，此外NSCLC患者可能发生脑转移，现有的治疗药物血脑屏障渗透性较差，治疗效果受到限制。

除crizotinib外，多种ALK抑制剂也已被用于复发性ALK阳性NSCLC患者的治疗，例如AP26113、CH5424802、ASP3026、LDK378，然而，这些化合物对脑转移的临床影响以及与临床前CNS暴露或脑肿瘤模型的关系尚不明确。

目标

基于背景分析，辉瑞的研究人员致力于发现具有CNS暴露及光谱抗癌活性的下一代的ALK抑制剂，用以克服耐药性突变及脑转移。此外，为了降低脱靶效应并提高治疗指数，需要抑制剂具有较高的激酶选择性。

达到目标的关键参数：亲脂性效率（LE）和分子量MW

通过增加效价与亲脂性的比率改善LE可以并行优化药物ADME性质及安全性。此外，在该系列化合物中log D与氧化代谢具有一定相关性，可以通过改善LE来确保结构的改变不会进一步增加化合物代谢负担。

由于分子量与细胞通透性反相关，因此降低分子量对于所需成药性（包括CNS暴露）至关重要。

无大环的氨基吡啶/氨基吡嗪ALK抑制剂

化合物1对于临床突变细胞系没有显示足够的抑制活性并且显示了较高的P-糖蛋白外排。优化的化合物6a虽然大大提高了野生型和L1196M突变抑制活性，但亲脂性较高，需要引入极性基团来降低整个分子的亲脂性，以获得可接受的LipE和良好的代谢稳定性。这种极性和分子量的增加导致大鼠脑脊液药物水平极低同时药物外排较高。

这些无大环结构的化合物无法同时兼顾效价和合理的MDR BA/AB比率来达到有效的CNS暴露。

为了平衡各方面属性，需要新的设计策略。

共晶

化合物6b与ALK共晶结构显示，氨基吡啶核通过受体-供体基序与蛋白质的铰链部分相互作用。苄基片段采用与甲氧基取代基共面的苄基氢构象，从而使A-1,3应变最小。苄基甲基和氟苯基都充满了亲脂性口袋。另外，芳基氟化物使邻芳基CH基团极化，从而与Gly1269和Arg1253上的主链羰基分子紧密接触并静电互补。三唑环的取向在30°扭转下与Gly1202残基的CH紧密接触，近似为CH供体-π相互作用。最终，配体下方的Leu1256残基填充了抑制剂的U形结构所形成的疏水袋。

6h与ALK的共晶结构显示，酰胺NH与水形成氢键，酰胺羰基通过水分子与His1124的羰基形成相互作用。6h与6i的交叠表明，酰胺的指向远离三唑基团的表面（酰胺的二面角（CCCO）为45°，而三唑的角（CCNN）为64°，大约有20°的偏差）。因此，甲基未指向与G环中的Leu1122，Gly1123和Val1130进行更强疏水相互作用所需的方向。

总体而言，共晶结构表明这些U型抑制剂的结合构象显示氟苯基“头部”和芳杂环“尾部”较为接近，基于此分析，研究者将化合物“头部”与“尾部”相连以锁定化合物构象。这样的结构修饰有望增强结合构象，减少可旋转键数量，增加小分子紧凑程度，可能改善其渗透性，由LipE和MW优化驱动的基于大环的结构设计将可能在不牺牲效价的情况下提供获得所需CNSADME性质的最高可能性。

大环ALK抑制剂

相对于无环化合物6b，大环类化合物均表现了改善的效价和LipE，然而大环醚通常过于亲脂，LipE依然需要进一步改善以满足效价、ADME、CNS暴露之间的平衡。

为进一步改善其LipE，研究者将醚键替换为内酰胺结构以降低亲脂性。将相应的无环化合物环化为内酰胺大环化合物后，细胞效价提高将近10倍，亲脂性降低了1个单位，且分子量没有提高。此外大环化合物还证明了优良的代谢稳定性及渗透性。总而言之，大环化合物较高的LipE和较低的MW可以满足CNS暴露需求而不牺牲效价和安全性。

选择性的实现

在ALK的ATP结合口袋有27个残基，ALKLeu1198残基在26%的蛋白激酶中是保守的（其他激酶该位置最常见的为Phe或Tyr），这个较小的Leu残基可能是获得针对大多数激酶（60%）的选择性的途径。

对应替代包含Phe/Tyr残基的激酶到ALK leu1198和TrkB。并且分析了几个大环衍生物与ALK的共晶结构，测量化合物与TrkB的Tyr635之间的距离。结果表明，AL结构中吡唑邻位的取代基可以接近TrkB Tyr635残基中的原子，其距离小于该对原子的范德华半径之和。其中8m与Tyr635距离最近，发生碰撞的可能性最大，此外，由于大环限制了化合物旋转导致取代基无法朝向远离Tyr/Phe残基的方向旋转。

CNS渗透

为了阐明提供低MDR外排量的理化特性，研究者对辉瑞MDR数据集进行了分析，该数据集在同一MDR渗透性模型中评估超过11.5万种化合物。结果表明，随着分子量或氢键供体数量（HBD）的增加，化合物流出机会增加。图6的饼图说明，与分子量，测得的log D和HBD计数相似的无环分子相比，大环抑制剂的MDR外排水平更低。值得注意的是，化合物8a、8l、8m显示出MDR BA/AB明显高于2.5，无法充分穿过BBB，而8j和8k均小于2.5，预计会进入CNS。

亲脂性效率比较

为评估大环及无环化合物的亲脂性效率指数差异，构建log D/重原子数与效价对应的散点图。结果表明，大环化合物相对无环化合物普遍具有较高的亲脂性效率（彩色方块）。

优选化合物8k体内外参数

基于优异的效价、选择性及平衡的ADME性质，化合物8k被优选出来进一步评价。相对化合物1，化合物8k显著提高了对ALK的细胞抑制活性，此外对大量的ALK临床突变细胞，8k的效价提高40-825倍。

对206个重组激酶进行筛选确认化合物8k有10个脱靶激酶，这些激酶相对于ALK-L1196M选择性小于100倍。

药代动力学结果显示，优选化合物具有较低的血浆清除率，适中的的分布体积、半衰期及优异的生物利用度。

大鼠中10mg/kg口服化合物8k证明了其能成功实现CNS暴露。

总结

大环化合物相对于无环化合物具有显著提高的效价及ADME性质（包括CNS暴露）。诸如TYK、MCl-1在内的众多靶点也显示了大环修饰策略的成功，是一种非常值得借鉴的修饰思路，但值得注意的是也应该考虑蛋白结合口袋的结构特点，不能一概而论，此外，成大环依然面临化学合成的诸多挑战。

参考文献

Ted W. Johnson, etal. Discovery of(10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16-trimethyl-15-oxo-10,15,16,17-tetrahydro-2H-8,4-(metheno)pyrazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazacyclotetradecine-3-carbonitrile(PF-06463922), a Macrocyclic Inhibitor of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) andc-ros Oncogene 1 (ROS1) with Preclinical Brain Exposure and Broad-SpectrumPotency against ALK-Resistant Mutations. J. Med. Chem. 2014, 57, 11,4720–4744.