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摘要：
目的： 目前胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）病理分级主要依赖病理形态学。然而，组织特征相同或相似的GBM往往具有不同的分子遗传学背景，这导致分级相同的个体间预后差异较大。这提示我们，患者自身的分子特征在指导治疗、评估疗效和预测预后方面发挥重要作用，直接影响着肿瘤的生物学行为。 代谢重编程常常发生在肿瘤细胞中,糖酵解增强会促进细胞生长和侵袭迁移，降低肿瘤细胞的化疗敏感性。在GBM四个分子亚型中，间质型GBM常伴有NF1基因的突变。NF1作为肿瘤抑癌基因，突变后下调其编码的神经纤维瘤蛋白，进而激活RAS-RAF-MAPK信号通路促进肿瘤增殖和转移。然而，对NF1基因突变的GBM细胞能量代谢模式的调控作用及对HDAC6抑制剂化疗敏感性的影响尚不清楚。 本研究的目的主要是探索NF1基因突变如何重塑GBM细胞能量代谢模式，及揭示NF1基因突变提高GBM对HDAC6抑制剂化疗敏感性的分子机制，为精准化疗提供新靶点和新策略。 方法： 1.首先利用肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和中国脑胶质瘤图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）数据库分析NF1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达及跟患者的预后情况；收集不同级别的胶质瘤患者的病理标本，用qPCR方法检测胶质瘤组织中NF1mRNA的表达; 2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除U251细胞NF1基因，通过挑选单克隆，建立NF1稳定敲除的U251细胞株。同时，构建NF1基因敲低的慢病毒载体，转染U251和U87细胞，建立稳定敲低表达的GBM细胞系以模拟NF1基因突变细胞； 3.通过能量代谢组学检测NF1基因突变和野生型U251差异表达的代谢产物。经KEGG通路富集分析筛选NF1敲除引起显著变化的通路。利用葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测NF1基因敲除之后细胞培养基中葡萄糖和乳酸的变化； 4.利用CP96实时无标记细胞生长分析仪来检测NF1敲低组和GBM对照组细胞增殖情况；通过划痕愈合实验以及Transwell小室实验，研究NF1敲低对GBM细胞侵袭和迁移的影响；利用Western blot和免疫荧光检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的变化； 5.线粒体形态和功能检测：利用mitorTrack线粒体染料进行染色在共聚焦显微镜观察其形态的变化；透射电镜观察线粒体形态的改变；用DCFH-DA试剂盒检测细胞活性氧；JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化；用ATP检测试剂盒检测ATP产生情况； 6.能量代谢的检测：利用Seahorse XF24细胞外流量分析仪检测NF1敲低对GBM细胞糖酵解和线粒体氧化磷酸化的影响；用WB和qPCR检测糖酵解相关蛋白（GLUT-1、HK2、PKM2、LDHA、HIF1a）和线粒体相关蛋白（ND1、SDHB、UQCRC2、MTCO2、ATP5A）的表达； 7.蛋白相互作用检测：利用细胞免疫荧光技术检测NF1分别和MFN1和p53的共定位；利用蛋白质免疫共沉淀验证其NF1分别和MFN1和p53蛋白的相互作用； 8.细胞凋亡检测：HDAC6抑制剂（Tubastatin A和CAY10603）分别诱导NF1敲低和对照组的细胞，利用流式细胞仪检测其HDAC6抑制剂对GBM细胞凋亡的影响；用Western blot检测线粒体凋亡通路蛋白（Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2）的表达； 9.动物实验：基于小动物脑立体定位仪，采用显微注射技术，结合小鼠脑图谱，向裸鼠大脑基底节区注射U87-Luc细胞，构建胶质瘤原位移植瘤模型。腹腔注射HDAC6抑制剂（Tubstanin A）后，利用小动物活体成像和核磁扫描观察对NF1敲低对GBM细胞化疗敏感性的影响。最后利用HE染色观察原位移植瘤的病理学形态，免疫组化检测各组中Ki-67的表达情况。 结果： 1.对TCGA和CGGA数据库的胶质瘤组织和正常样本的转录组数据分析显示，NF1mRNA在胶质瘤组织中表达显著降低，且NF1mRNA的表达跟胶质瘤的级别呈负相关。同时，NF1可作为一个独立的预后因子评价患者的预后，NF1表达越高患者的预后越好（p＜0.0001）。qPCR亦证明在胶质瘤组织中NF1表达显著降低（p＜0.05）。 2.对NF1敲低的U251细胞能量代谢组学分析显示，NF1基因敲除差异的能量代谢物主要与糖酵解、嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸糖的代谢等密切相关，且呈负相关。 3.CP96实时无标记细胞生长分析仪、划痕愈合实验以及Transwell实验表明，NF1敲低抑制了GBM细胞增殖，且促进了GBM细胞的侵袭和迁移。用免疫荧光和Westernblot检测发现NF1敲低之后表皮标记物E-cadherin蛋白表达明显降低，间充质标记物N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显升高，NF1基因敲低促进GBM细胞EMT的发生。 4.利用DCFH-DA、JC-1和ATP检测试剂盒发现NF1敲低之后，细胞内活性氧水平增加；线粒体膜电位显著降低，线粒体ATP的产生减少（p＜0.05）。 5.利用Seahorse XF24细胞外流量分析仪检测发现，NF1敲低的GBM细胞中糖酵解能力增强，线粒体氧化磷酸化水平降低。且WB结果显示，NF1基因敲低促进了AKT和mTOR的磷酸化，激活AKT/mTOR信号通路，促进LDHA、C-Myc、HIF1a和PKM2蛋白的表达。降低了ND1、SDHB和UQCRC2蛋白的表达。 6.透射电镜我们观察到，NF1基因敲除促进了线粒体的分裂；蛋白质免疫共沉淀实验结果显示，NF1通过调节MFN1的表达抑制线粒体的分裂，MFN1通过泛素蛋白酶体途径促进其降解。 7.通过生物信息学方法分析发现，HDAC6在GBM组织中表达升高，且与NF1表达呈负相关；同时我们发现，NF1基因敲除增强了GBM细胞对HDAC6抑制剂（Tubastatin A和CAY10603）的化疗敏感性，并通过增强p53K120AC、p53K382AC和p53K370AC的表达促进了其凋亡。Co-IP结果展示，NF1与p53存在相互直接作用。 8.通过体内实验发现，HDAC6抑制剂（Tubastatin A）在体内能够显著抑制原位移植瘤的生长，且对NF1敲低组更明显（p＜0.05）；免疫组化结果显示，Tubastatin A处理的NF1敲低组Ki-67表达更低（p＜0.05）。 结论： 1.NF1在GBM中表达显著降低跟患者预后显著相关，可作为GBM患者的预后标志物。 2.NF1基因可能与促进GBM细胞侵袭、迁移和EMT的发生相关。 3.NF1基因突变，通过激活AKT/mTOR信号通路促进GBM细胞的有氧糖酵解，通过靶向调控MFN1蛋白促进线粒体的分裂，抑制了线粒体氧化磷酸化。NF1的突变可能通过增强有氧糖酵解和线粒体的分裂促进GBM细胞EMT的发生。 4.HDAC6抑制剂（Tubastatin A和CAY10603）能够抑制GBM细胞增殖且通过激活线粒体凋亡途径促进其凋亡。 5.HDAC6抑制剂通过靶向抑制HDAC6活性和稳定p53赖氨酸382、120和370残基乙酰化水平提高了NF1基因敲除的GBM细胞对HDAC6抑制剂的化疗敏感性。
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