程序进样

吴海智，肖玥惠子，朱礼，袁列江，王淑霞，黄渊圆

（湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南长沙410007）

摘 要：建立快速高效检测乳制品中牛磺酸含量的程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法。该方法对牛磺酸提取试剂、衍生化试剂、衍生方式、仪器色谱条件进行优化。通过设定进样程序，简化样品前处理衍生操作，大幅度缩短了检测时间。试验结果表明，方法加标回收率为99.2%～104.0%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.22%～5.25%，线性相关系数R2=0.999 9，定量限为0.2 mg/100 g。同时对牛乳羊乳中的牛磺酸含量进行测定，结果显示全脂牛奶粉和全脂羊奶粉中牛磺酸的含量范围分别为2.89mg/100g～7.42mg/100g和36.6 mg/100 g～60.4 mg/100 g；纯牛奶和纯羊奶中牛磺酸的含量范围分别为0.37mg/100 g～0.68 mg/100 g和4.20 mg/100 g～6.10 mg/100 g。羊乳的牛磺酸均明显高于牛乳，其含量比值≥9，差异显著。

关键词：程序进样；柱前衍生；高效液相色谱法；牛磺酸；乳制品

牛磺酸（taurine）别名牛胆素、牛胆酸，化学式为C2H7NO3S，无臭，微酸，易溶于水[1]。牛磺酸分布于动物组织细胞内，具有保肝利胆、抗心律失常、预防心血管疾病和提高免疫力的生理作用，能够促进婴幼儿脑组织和智力发育 [2-4]。我国于1993年批准牛磺酸在乳制品、婴幼儿食品及谷类制品、强化饮料中添加作为功能营养剂使用[5]。目前牛磺酸的测定方法主要有荧光光谱法、薄层色谱法、离子交换紫外分光光度法和高效液相色谱法[6-12]。现行的国家标准方法GB 5009.169—2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》第二法采用丹磺酰氯柱前衍生，衍生过程操作繁琐，耗时很长且稳定性较差，样品在冷藏条件下仅能保存2d[13]。本研究采用程序进样的方式实现对乳制品牛磺酸进行快速测定，利用自动进样器完成衍生，衍生化试剂使用量小，试验操作简单，减少了人工操作产生的误差，适用于乳制品中牛磺酸的测定。

因羊乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等，且更利于人体消化吸收，对保护视力和快速恢复体能有很大益处[14]，市售羊乳的价格远高于牛乳。因此需要建立一种简单有效鉴别羊乳真伪的方法，以确保羊乳制品质量和安全[15]。牛磺酸是人和动物必需的一种氨基酸，牛奶中牛磺酸含量较低，使用牛奶喂养婴幼儿相对母乳喂养的婴儿发育较为迟缓，主要原因之一是牛奶中缺乏牛磺酸[16]，而羊乳中含有很多容易被人体消化吸收的游离氨基酸。因此通过对羊乳、牛乳中牛磺酸含量进行测定，来鉴别羊乳的真伪具有可行性。本文利用程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定检测分析不同品种及地域的乳制品中牛磺酸含量，探索建立以牛磺酸为特征指标的评价方法应用于羊乳的真伪鉴别。

1.1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元汞、脱气机、自动进样器、柱温箱、化学工作站、荧光检测器）、ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱：美国安捷伦公司；Q224-1CN电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Allegra 25R高速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；KQ－250B超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2 试剂材料

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、硫酸钾（分析纯）、硼酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲醛（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛磺酸标准品（纯度≥99.9%）、月桂醇聚氧乙烯醚、2-巯基乙醇（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

全脂羊奶粉、全脂牛奶粉：湖南省产商品质量监督检验研究院提供；纯羊奶、纯牛奶：市售。

1.1.3 试剂的配制

亚铁氰化钾溶液（150 g/L）：称取15.0 g亚铁氰化钾，用去离子水溶解并定容至100 mL；乙酸锌溶液（300 g/L）：称取30.0 g乙酸锌，用去离子水溶解并定容至100 mL；流动相A：称取4.78 g磷酸二氢钠，加入1 000 mL去离子水溶解，用10 mol/L NaOH溶液调至pH 7.8；流动相B：移取500 mL乙腈加入500 mL甲醇，超声混匀；硼酸-碳酸钠缓冲溶液：称取碳酸钠40.7 g，硫酸钾18.8 g，硼酸13.57 g，加去离子水定容至1 L；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）衍生溶液：称取邻苯二甲醛400 mg，加入甲醇7 mL，2-巯基乙醇1 mL，10%月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35）2 mL，用硼酸-碳酸钠缓冲溶液定容至500 mL。

1.1.4 标准溶液配制

准确称取0.100 0 g牛磺酸标准品，用水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的储备液。吸取储备液10 mL，用水定容至100 mL，配制成100 μg/mL的中间液，再分别吸取一定量的中间液用水稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的标准工作溶液。

1.2.1 样品的前处理

准确称取固体试样2 g，液体试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加25 mL 40℃左右温水，涡旋混匀溶解后，放入超声波振荡器超声辅助提取10 min。加1.0 mL乙酸锌溶液和1.0 mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，放入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，充分混匀。样液于5 000 r/min下离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，上机测试。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相为流动相 A∶流动相 B=85∶15（体积比）；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；检测波长为激发波长：338 nm，发射波长：425 nm；进样量：1 μL。

1.2.3 自动进样器进样程序

吸取（在固定位置）2.0 μL硼酸-碳酸钠缓冲溶液后，吸取（在指定位置）1.0 μL样品，混合等待0.5 min；洗针，再吸取（在固定位置）1.0 μL OPA衍生溶液，洗针，吸取（在固定位置）32 μL去离子水，混合，进样。

使用Agilent 1200高效液相色谱仪配套的色谱处理软件完成数据采集分析，试验数据使用Microsoft ex－cel软件进行整理与分析。

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第一法、第二法分别选用偏磷酸溶液（30 g/L）、水作为牛磺酸的提取试剂。本方法鉴于牛磺酸极易溶于水，选择水作为提取试剂，试样中牛磺酸经水超声辅助提取后直接上机测定。

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法使用丹磺酰氯为衍生化试剂，通过分别使用丹磺酰氯和邻苯二甲醛衍生化试剂对牛磺酸进行柱前衍生，结果为使用丹磺酰氯衍生化试剂进行柱前衍生灵敏度相对邻苯二甲醛要低，色谱峰峰型较差，且其衍生物稳定性较邻苯二甲醛衍生物较差。综合考虑，使用邻苯二甲醛为本方法使用的衍生化试剂。

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法使用人工手动衍生的方式，该方法衍生过程比较繁琐，而且耗时2 h以上。且衍生物稳定性较差，样品在冷藏条件下仅能保存2 d，对试验时间控制要求较高。本方法采用程序进样解决了牛磺酸衍生物进样先后顺序会影响测试结果的难题，自动进样器衍生后立即自动进入色谱柱内进行分析，保证了标准品和样品的衍生时间的一致性，且大大提高了工作效率，减少了人员操作而产生的误差。

本方法采用磷酸盐缓冲液和乙腈甲醇流动相体系对样品中牛磺酸进行洗脱，并对比了ZORBAX E-clipse-AAA与ZORBAX EXTEND-C18柱的分离效果，最终选用ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱对牛磺酸进行分离，同时通过调节流动性的配比及流动相的pH值，得到的色谱图见图1～图2。

图1 牛磺酸标准品的色谱图Fig.1 Chromatogram of taurine standard

图2 样品中牛磺酸的色谱图Fig.2 Chromatogram of taurine in sample

由图1～图2可知，本研究选取的色谱条件取得了很好的分离度和峰形。

为消除不同乳制品基质的测定影响，保证方法的通用性和适用性。进样程序中，加入硼酸-碳酸钠缓冲溶液，用以调节测试液的pH值，提高了测定的稳定性，并通过设置多次清洗进样针头程序，最大程度降低了样品间的相互干扰。

2.6.1 标准曲线及线性方程

按优化的色谱条件，将标准工作溶液依次经高效液相色谱仪测试分析，通过浓度对峰面积的线性拟合得牛磺酸的线性方程及相关系数见表1。

表1 线性方程及相关系数Table 1 The linear equation and correlation coefficient

化合物 线性方程 相关系数R2牛磺酸 y=56.962x-3.532 0.999 9

由表 1 可知，牛磺酸在 0.5 μg/mL～50 μg/mL 浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 9，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》“对于确证方法，相关系数不应低于0.99”的要求。

2.6.2 精密度、回收率

在纯牛奶中进行 3 个水平（1.0、10.0、40.0mg/100g），6个平行的加标回收试验，测定后得到牛磺酸的加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2 加标回收率试验结果（n=6）Table 2 Results of recovery rate（n=6）

添加水平/（mg/100 g）平均回收率/%相对标准偏差/%1.0 104.0 5.25 10.0 99.2 5.03 40.0 101.0 3.22

由表2可知，在本试验条件下，3个添加水平下牛磺酸的平均回收率为99.2%～104.0%，相对标准偏差为3.22%～5.25%，方法加标试验结果满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》要求。

2.6.3 准确度

本方法与GB 5009.169—2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》方法比对结果见表3。

表3 方法比对结果Table 3 The results of method comparison

编号本方法检测值/（mg/100 g）GB5009.169—2016（第一法）检测值/（mg/100 g）GB5009.169—2016（第二法）检测值/（mg/100 g）相对极差/%1 2.91 2.76 2.89 5.26 2 7.65 7.08 7.42 7.72 3 54.70 59.10 54.20 8.75

由表3可知，不同方法的测试结果的相对极差均小于算术平均值的10%，表明本方法具有较高的准确度。

2.6.4 方法检出限、定量限

在10 g纯牛奶样品中加入1 mL牛磺酸标准工作溶液（20 μg/mL），以基线10倍噪声值为定量限在标准曲线查得结果计算，测得方法定量限为0.2 mg/100 g。

对6批次的不同品牌全脂牛奶粉、6批次不同品牌全脂羊奶粉、6批次不同品牌纯牛奶、6批次不同品牌纯羊奶的牛磺酸含量进行测定，测定结果分别见表 4、表 5。

表4 奶粉测定结果Table 4 Test results of milk powder

牛奶粉 产地 牛磺酸含量/（mg/100 g） 奶粉 产地 牛磺酸含量/（mg/100 g）1号 新西兰 5.52 1号 法国 54.2 2号 荷兰 6.45 2号 中国 39.4 3号 中国 4.16 3号 中国 40.2 4号 新西兰 2.89 4号 荷兰 60.4 5号 澳大利亚 3.12 5号 中国 55.6 6号 中国 7.42 6号 西班牙 36.6平均值 国产 5.79 平均值 国产 45.1平均值 进口 4.50 平均值 进口 50.4全脂 全脂羊

表5 液体奶测定结果Table 5 Test results of liquid milk

纯牛奶 产地 牛磺酸含量/（mg/100 g） 纯羊奶 产地 牛磺酸含量/（mg/100 g）1号 云南 0.68 1号 陕西 4.20 2号 贵州 0.47 2号 陕西 4.21 3号 云南 0.41 3号 陕西 6.10 4号 重庆 0.37 4号 陕西 4.65 5号 重庆 0.52 5号 陕西 4.55 6号 内蒙古 0.53 6号 陕西 5.75

由表4可见，全脂牛奶粉牛磺酸的含量范围为2.89 mg/100 g～7.42 mg/100 g，全脂羊奶粉牛磺酸的含量范围为 36.6 mg/100g～60.4 mg/100 g。

由表5可见，纯牛奶牛磺酸的含量范围为0.37 mg/100 g～0.68 mg/100 g。纯羊奶牛磺酸的含量范围为4.20 mg/100g～6.10 mg/100 g。不同产地及品牌的乳制品中牛磺酸均略有差异，主要原因是泌乳动物品种、气候、产奶期以及生产工艺的差异。国产和进口乳制品中牛磺酸并无明显差异。羊乳与牛乳的结果比较见表6。

表6 羊乳与牛乳结果比较Table 6 The results of goat milk and cow milk comparison

样品类别牛磺酸平均含量/（mg/100 g）羊牛乳中牛磺酸比值全脂牛奶粉 4.93 9.67全脂羊奶粉 47.70纯牛奶 0.50 9.82纯羊奶 4.91

从表6的数据可以看出，无论是奶粉样品还是液体奶样品，羊乳的牛磺酸均明显高于牛乳，其比值均≥9，差异显著。

本文对乳制品中牛磺酸的检测方法进行了研究，建立了快速高效检测乳制品中牛磺酸含量的程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法。试验结果表明，方法加标回收率为99.2%～104.0%，相对标准偏差为3.22%～5.25%，线性相关系数R2=0.999 9，定量限为0.2 mg/100 g。该方法样品前处理简单，试剂消耗少，分析时间短，准确性和精密度好，适用于乳制品中牛磺酸的定性定量检测。本研究通过对全脂牛奶粉、全脂羊奶粉、纯牛奶、纯羊奶中的牛磺酸含量进行了测定。测定结果显示，纯羊奶中牛磺酸的平均含量高达4.91 mg/100 g，全脂羊奶粉中牛磺酸的平均含量高达47.70 mg/100 g，均为牛乳的9倍多，这就为以牛磺酸为特征指标区别牛羊乳提供了参考依据。

参考文献：

[1]方宏兵,王德强.食品中牛磺酸的检测方法研究进展[J].粮油食品科技,2011,19(4):45-47.FANG Hongbing,WANG Deqiang.Research progress of determination of taurine in foods[J].Science and Technology of Cereals,Oils and Foods,2011,19(4):45-47.

[2]闫浩,黄河.牛磺酸是否可以作为营养添加剂?[J].肿瘤代谢与营养电子杂志,2015,2(1):67-70.YAN Hao,HUANG He.Should taurine act as nutritional supplement?[J].Electronic Journal of Metabolism and Nutrition of Cancer,2015,2(1):67-70.

[3]王丙然,任德财,李星,等.婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的检测研究进展[J].食品与发酵工业,2020,46(22):287-291.WANG Bingran,REN Decai,LI Xing,et al.Research progress of taurine detection in infant formula milk powder[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(22):287-291.

[4]杨美玲,陈瑞仪,张紫虹,等.地龙蛋白和牛磺酸的抗疲劳作用和免疫调节功能的研究[J].中国热带医学,2015,15(5):552-554.YANG Meiling,CHEN Ruiyi,ZHANG Zihong,et al.Effects of earthworm active protein and taurine on physical fatigue and immunologic function of mice[J].China Tropical Medicine,2015,15(5):552-554.

[5]刘柱,陈万勤,王瑾,等.酶解反应-柱前衍生-高效液相色谱法测定高淀粉类食品中的牛磺酸[J].理化检验-化学分册,2013,49(9):1079-1082.LIU Zhu,CHEN Wanqin,WANG Jin,et al.HPLC determinination of taurine in high-starch food by pre-column derivatization after enzymolysis[J].Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis),2013,49(9):1079-1082.

[6]李珊,刘玉兰.荧光法测定食物中牛磺酸[J].理化检验-化学分册,2001,37(2):80-81.LI Shan,LIU Yulan.Fluorophotometric determination of taurine in foodstuff[J].Physical Testing and Chemical Analysis Partb Chemical Analgsis,2001,37(2):80-81.

[7]劳燕文,杨益林.母乳泉口服液中牛磺酸的测定[J].现代仪器,2006,12(1):65-66.LAO Yanwen,YANG Yilin.Tested of taurine for Muru Quan preparations[J].Modern Instruments,2006,12(1):65-66.

[8]陈季凤.解决儿童营养液中牛磺酸的薄层色谱鉴定法[J].基层中药杂志,1994,8(3):28.CHEN Jifeng.Determination of taurine in children's nutrient solution by TLC[J].Primary Journal of Chinese Materia Medica,1994,8(3):28.

[9]李秀花,邱服斌,肖荣,等.紫外分光光度法测定动物脑组织中牛磺酸含量[J].山西医药杂志,2001,30(3):209-210.LI Xiuhua,QIU Fubin,XIAO Rong,et al.Determination of taurine content in anim al's brain by ultravioletspectrophotometry[J].Shanxi Medical Journal,2001,30(3):209-210.

[10]娄婷婷,赵婷,温华蔚,等.婴儿食品中牛磺酸含量测定及其不确定度分析[J].食品研究与开发,2016,37(24):120-124.LOU Tingting,ZHAO Ting,WEN Huawei,et al.Determination and uncertainty evaluation for taurine in infant formula[J].Food Research and Development,2016,37(24):120-124.

[11]孟冰冰,杨桂玲,徐惠,等.程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼露酱油中的牛磺酸含量[J].中国调味品,2017,42(5):138-140.MENG Bingbing,YANG Guiling,XU Hui,et al.Determination of taurine in fish sauce by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography[J].China Condiment,2017,42(5):138-140.

[12]徐彬,李飞,赵海萍,等.柱前衍生法测定功能性饮料与口服液中的牛磺酸[J].食品研究与开发,2019,40(10):145-151.XU Bin,LI Fei,ZHAO Haiping,et al.Determination of taurine in energy drinks and oral liquids by pre-column derivatization[J].Food Research and Development,2019,40(10):145-151.

[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定GB 5009.169—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.State Health and Family Planning Commission of the People's Re－Public of China.National food safety standards Determination of taurine in food:GB 5009.169—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.

[14]黄晓庆,钟秀娟,张多敏,等.谷物羊奶的杀菌工艺研究[J].现代食品科技,2011,27(12):1487-1489.HUANG Xiaoqing,ZHONG Xiujuan,ZHANG Duomin,et al.Study on the sterilization conditions for the corn goat milk[J].Modern Food Science and Technology,2011,27(12):1487-1489.

[15]王坤,叶兴乾,关荣发.羊乳及其奶酪中掺入牛乳检测的研究[J].食品与发酵工业,2005,31(10):136-138.WANG Kun,YE Xingqian,GUAN Rongfa.Determination of bovine milk in ewes'and goats'milk and cheese[J].Food and Fermentation Industries,2005,31(10):136-138.

[16]赵超敏,蒋颖婕,曾静,等.高效液相色谱法测定乳粉及液态奶中牛磺酸含量[J].现代食品科技,2019,35(1):252-256,205.ZHAO Chaomin,JIANG Yingjie,ZENG Jing,et al.Determination of taurine content in milk powder and liquid milk by high performance liquid chromatography[J].Modern Food Science and Technology,2019,35(1):252-256,205.

Determination of Taurine Content in Dairy Products Using Program Sampling-Precolumn Derivatization-High Performance Liquid Chromatography

WU Hai-zhi，XIAO Yue-hui-zi，ZHU Li，YUAN Lie-jiang，WANG Shu-xia，HUANG Yuan-yuan（Hunan Testing Institute of Product and Commodity Supervision，Changsha 410007，Hunan，China）

Abstract：A rapid and efficient method for the determination of taurine content in dairy products was established.Extraction reagent，derivatization reagent，derivatization method and instrumental chromatographic conditions for evaluation of taurine content were optimized.By setting the injection procedure，sample pretreatment and derivatization operation were simplified，and detection time was greatly shortened.The results showed that recoveries were 99.2%-104.0%，relative standard deviation was 3.22%-5.25%，linear correlation coefficient R2 was 0.999 9，and limit of quantification was 0.2 mg/100 g.In addition，taurine content in whole cow milk powder/whole goat milk powder was 2.89 mg/100 g-7.42 mg/100 g and 36.6 mg/100 g-60.4 mg/100 g，respectively，while that in pure cow milk/pure goat milk was 0.37 mg/100 g-0.68 mg/100 g and 4.20 mg/100 g-6.10 mg/100 g，respectively.Taurine content in goat milk was significantly higher than that in cow milk，and its content ratio was more than or equal to 9.

Key words：program sampling；precolumn derivatization；high performance liquid chromatography；taurine；dairy products

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.21.018

基金项目：国家市场监督管理总局科技计划项目（2019MK062）

作者简介：吴海智（1986—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：食品安全与检测。

引文格式：

吴海智，肖玥惠子，朱礼，等.程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定乳制品中牛磺酸含量[J].食品研究与开发，2021，42（21）：116-120.

WU Haizhi，XIAO Yuehuizi，ZHU Li，et al.Determination of Taurine Content in Dairy Products Using Program Sampling-Precolumn Derivatization-High Performance Liquid Chromatography[J].Food Research and Development，2021，42（21）：116-120.

加工编辑：姚骏

收稿日期：2021-06-03