组蛋白去乙酰化酶6的结构、功能及选择性抑制剂的研究进展

表观遗传学调控是一个动态可逆的、不涉及DNA序列改变但是可遗传的过程,与细胞增殖、分化和凋亡关系密切。组蛋白的共价修饰可调节染色质的状态,进而影响基因的表达,因而在表观遗传学调控中占有重要地位。组蛋白乙酰化修饰是组蛋白共价修饰的重要方式之一,由组蛋白乙酰转移酶 (histone acetyltransferase,HAT) 和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase,HDAC) 协同控制。至今,已有4类18种哺乳动物HDAC得到确认: I类 (HDAC1～3,8)、II类 (II a类: HDAC4,5,7,9; II b类: HDAC6,10)、III类 (SIRT1～7) 和IV类 (HDAC11)。I、II和IV类为Zn2+依赖型蛋白酶; 而III类为NAD+依赖型[1, 2]。

常见的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (HDACi) 包括表面识别区、连接区、锌离子结合区 (ZBG) 3部分。目前,伏立诺他 (vorinostat,1)、罗米地辛(romidepsin,2) 和belinostat (3) (图 1) 已被FDA批 准上市,还有一些抑制剂正在临床研究中。这些抑制剂大多是广谱的或多亚型选择性的,因而可能具有不必要的副作用[3]。HDAC6具有独特的结构和底物特异性,其表达和功能的改变与多种疾病密切相关,因此发展选择性HDAC6抑制剂已引起广泛关注。本文总结了近年来HDAC6及其选择性抑制剂 的研究进展。

HDAC6基因定位于X染色体p11.22～23区带,约21 923 bp,由28个位于41至677 bp间的外显 子编码[4]。HDAC6蛋白含1 215个氨基酸残基,是HDAC家族中最大的。HDAC6的主要结构域包括核定位信号区 (NLS)、两个保守的富含亮氨酸的核输出信号区 (NES1,NES2)、两个串联的去乙酰化催化区 (DD1,DD2)、含丝氨酸-谷氨酸的十四肽重复区域(SE14) 及锌指结构 (ZnF-UBP)[5, 6, 7, 8, 9]。虽然结构中存在NLS,但是在NES和SE14的联合作用下,HDAC6主要存在于细胞质中。NES的作用是阻止HDAC6与细胞核蛋白结合,有利于其从细胞核转运至细胞质,而SE14则将HDAC6固定在细胞质[5]。两个去乙酰化催化区均有去乙酰化活性,但体外的去乙酰化活性主要由C端的DD2来完成[7, 8]。ZnF-UBP也被称为泛素结合区 (图 2)。

与其他亚型不同的是,HDAC6具有独特的非组蛋白底物特异性,其作用的底物主要包括α-微管蛋白、皮动蛋白和热休克蛋白90 (Hsp90)[10, 11, 12, 13, 14]。这些蛋白都是在胞浆中表达的,与HDAC6的亚细胞定位相符,但是某些条件下HDAC6也会出现在细胞核中[15]。

α-微管蛋白是第一个被证实的HDAC6去乙酰化底物,其可逆的乙酰化状态能够显著影响微管的稳定性和功能[10]。例如: HDAC6的过度表达会导致微管蛋白处于低乙酰化水平,并促进趋化性细胞运动; 相反,抑制HDAC6功能导致微管蛋白超乙酰化及黏着斑过度聚积,进而抑制纤维原细胞运动。除了调节微管蛋白依赖的细胞运动,HDAC6还可改变皮动蛋白的乙酰化状态,影响其结合纤维状肌动蛋白的能力,从而调节肌动蛋白依赖的细胞运动[14]。研究人员还发现HDAC6能够调节Hsp90的乙酰化状态[11, 12]。由于Hsp90可增加许多重要信号蛋白的活性和稳定性,因此HDAC6对Hsp90乙酰化状态的调控也是其影 响细胞信号传导的重要因素[16]。

除了去乙酰化酶的活性外,HDAC6还有结合泛素功能[9, 17]。正常情况下错误折叠蛋白可被蛋白酶体有效降解。当蛋白酶体受损时,错误折叠蛋白形成聚合物。此聚合物在去泛素化酶ataxin-3作用下产生HDAC6结合位点。HDAC6与这些聚合物结合后,一方面可与动力蛋白复合物形成三聚体,将错误折叠蛋白沿微管逆向转运到微管组织中心形成聚集体,最终通过自噬消除; 另一方面,可激活热休克转录因子1 (HSF1),诱导Hsp25、Hsp70的表达,指导蛋白质正确折叠,参与错误折叠蛋白的修复降解。

HDAC6在某些肿瘤细胞中表达异常[18, 19],例如原发性口腔鳞癌细胞中HDAC6的表达上调,并且 其表达水平与肿瘤分期相关[20]。研究发现HDAC6可激活致癌Ras信号通路和肿瘤细胞存活信号通路,使转化的细胞进行锚定非依赖性的增殖,有利于细胞逃避失巢凋亡现象而存活,从而促进肿瘤的发生和转化[21]。另外,许多致癌蛋白的结构成熟和活性需要HDAC6底物Hsp90的参与,当HDAC6失活时,Hsp90超乙酰化,肿瘤生长受到抑制。

神经退行性疾病中常见轴突运输功能受损、线粒体转运功能紊乱和错误折叠蛋白积聚[22, 23, 24]。HDAC6与相关蛋白相互作用改善并修复这些功能,产生治疗神经退行性疾病的效果。例如,抑制HDAC6可升高α-微管蛋白乙酰化水平,进而改善受损的轴突运输功能,产生神经保护作用; 线粒体泛素化后可以募集HDAC6,从而实现对受损线粒体的自噬。

此外,研究表明HDAC6与自身免疫性疾病相 关[25, 26]。HDAC6可抑制调节性T细胞介导的免疫抑制,而抑制HDAC6可增强调节性T细胞功能并恢复免疫稳态[26]。

HDAC6通过与底物蛋白相互作用,参与并调节众多生理或病理进程,其选择性抑制剂在治疗多种疾病方面具有广阔的前景。在同源模建和分子对接等计算机辅助药物设计技术的帮助下,研究人员设计出了形式多样的选择性HDAC6抑制剂,这些抑制剂具有纳摩尔甚至皮摩尔的HDAC6抑制活性,并表现出明显的HDAC6选择性。

第一个选择性HDAC6抑制剂是Haggarty等[27, 28]在2003年报道的tubacin (4)。Tubacin为“T”字型结构,表面识别区结构独特,含五个芳香环及一个三手性中心的二氧六环。研究表明tubacin对HDAC1、HDAC6和HDAC8不同的作用主要来源于I类和II类HDAC催化通道周围蛋白表面的差异[29]。Tubacin可诱导α-微管蛋白的乙酰化,而对组蛋白的乙酰化、基因表达及细胞周期无影响; 此外,研究发现该化合物可抑制HDAC6和动力蛋白dynein之间的相互作用,从而引起泛素化蛋白积聚[30]。

化合物5、6的结构与tubacin类似,仅表面识别区存在差异[31, 32]。研究表明化合物5结构中1,2,3-三氮唑及其取代的变化对HDAC6选择性的影响不 大,取代苯基是产生选择性的结构决定因素; 化合物6连接区的长度及氨基的保护基影响其对HDAC6的活性和选择性。化合物5、6均可抑制胰腺癌细胞生长,且化合物6的抑制效果为SAHA的10倍左右。

Rocilinostat (ACY-1215,7) 是目前唯一一个进入临床研究的选择性HDAC6抑制剂[33],其与bortezomib或lenalidomide合用对多发性骨髓瘤 (multiple myeloma,MM) 可以产生协同治疗作用。该疗法具体的作用机制还未完全明了,其中一种解释为药物同时抑制了泛素-蛋白酶体通路和聚集体降解通路,导致细胞内错误折叠蛋白聚积,最终诱发细胞凋亡。

化合物8为环肽类选择性HDAC6抑制剂,含环α3β四肽骨架,通过珠一化法 (one-bead-one-compound) 获得,可抑制HeLa细胞生长[34]。化合物9为手性大环内酰胺类选择性HDAC6抑制剂,对肺癌和结肠癌细胞 (H460和HCT-116) 表现出优于SAHA的细胞毒活性[35]。

Smil等[36]对apicidin (10) 的结构改造得到了一系列具有手性的选择性HDAC6抑制剂 (如11)。研究表明该类化合物对HDAC6的抑制活性和选择性取决于手性基团的绝对构型,R型化合物优于S型; 大多数化合物可有效诱导α-微管蛋白乙酰化,而对组蛋白H3乙酰化无影响,这进一步确证化合物的HDAC6选择性。

Tubastatin A (12) 及其衍生物是已报道的活性、选择性和类药性最高的HDAC6抑制剂,该类化合物的结构差异在于咔啉环的类型及N-取代[37, 38]。在皮层原代神经元培养中tubastatin A对谷胱甘肽耗竭诱导的氧化应激具有剂量依赖性保护作用。化合物13是tubastatin A的砜类衍生物,研究表明tubastatin A砜类衍生物的活性优于其相应的硫醚类化合物。大多数此类化合物可促进转录因子FOXp3的乙酰化,该转录因子在T细胞免疫应答中发挥重要作用,因而该类化合物具有治疗自身免疫性疾病的潜在价值[39]。

Nexturastat A (14) 和HPOB (15) 为N,N-二取代的“Y”形结构化合物[40, 41]。对nexturastat A及其衍生物的研究表明,脲N-取代,尤其是靠近ZBG的N-取代可增加化合物对HDAC6的抑制活性和选择性。14可有效抑制B16黑色素瘤细胞的生长; 15可增强依托泊苷、多柔比星或SAHA诱导的肿瘤细胞死亡,而且在浓度 ≤ 16 μmol·L-1时15对正常细胞无明显影响。

Blackburn等[42]认为苄基能更有效地与HDAC6 的催化通道结合,因而有利于对HDAC6的选择性,并以4-胺甲基-N-羟基苯甲酰胺的酰化物为先导合成不同大小的杂环衍生物 (如16)。化合物16具有良好的HDAC6抑制作用和选择性,对基质金属蛋白酶几乎没有抑制 (>100 μmol·L-1),而且水溶性好 (pH 7.5时2 mmol·L-1)。

研究发现大多数含取代苯基和肉桂酸骨架的化合物抗增殖活性优于SAHA[43]。其中ST3595 (17) 具有HDAC6选择性,该化合物与紫杉醇合用可产生协同抗癌作用[44]。2位和3位取代的喹唑啉-4-酮类化合物 (如18) 表现出明显的HDAC6抑制活性和选择性,具有治疗神经退行性疾病的潜力: 对神经元和Vero细胞无毒副作用,在体外可抑制锌离子介导的Aβ聚积,也可诱导轴突生长和突触活动[45]。

Lee等[46]合成一系列含吲哚/氮杂吲哚的N-羟 基肉桂酸类HDAC抑制剂。研究发现含7-氮杂吲哚的化合物19对HDAC6的抑制活性及选择性要优于含吲哚、吲唑、6-氮杂吲哚和7-氮杂吲唑的化合物。该化合物小鼠的口服生物利用度为33%,对结直肠癌HCT116细胞的抑制作用优于SAHA。

巯基具有较好的锌离子亲和力,巯基成酯有利于提高化合物稳定性和亲脂性。研究表明含有氨基甲酸叔丁酯基团及大体积烷基的化合物 (如20) 具有良好的HDAC6抑制活性和选择性[47, 48, 49]。化合物20可抑制雌激素α受体阳性的乳腺癌MCF-7细胞的生长,与紫杉醇合用还可产生协同抗肿瘤作用。该化合物的巯基换为异羟肟酸后仍具有HDAC6选择性,表明巯基或许不是该化合物产生HDAC6选择性的决定因素[50]。

研究发现含氨基酸残基修饰的2,4'-二氨基联苯类化合物 (如21) 具有HDAC6选择性,可保护皮层神经元免受氧化应激引起的死亡危害[51],但该类化合物易经氧化二聚形成二硫物而失活。为了解决这个问题,同一课题组通过结构改造并合成了一系列二芳基衍生物 (如22)[52]。这些化合物对胰腺癌细胞具有良好的抑制活性。进一步的研究发现α位取代,尤其是α位R-甲基取代,会提高化合物对HDAC6的选择性[53]。

三氟乙酰噻吩类化合物被发现具有II类HDAC选择性抑制活性[54],该类化合物在细胞中易被羰基还原酶快速代谢而失活。对此改造过程中发现了化合物23,其稳定性提高 (HCT116细胞中t1/2 = 11 h),并具有良好的HDAC6抑制活性和选择性[55]。研究发现线型长链磺胺类化合物 (如24) 具有HDAC6选择性,而具有赖氨酸骨架的磺胺类化合物对HDAC1和HDAC6都均有明显抑制作用[56]。

Inks等[57]通过化合物筛选发现了具有HDAC6选择性的萘醌类化合物 (如25)。虽然结构中含Michael受体,但大多数化合物没有明显毒性。在人AML细胞中,NQN-1 (25) 可诱导微管蛋白和Hsp90的高度乙酰化; 该化合物还能引起Hsp90下游蛋白mutant FLT-3降解及STAT5的成型活化。一些不含表面识别区的异羟肟酸类小分子 (如26) 被证明具有良好的HDAC6抑制活性和选择性[58],研究发现异羟肟酸α位的sp2碳原子有利于化合物的HDAC6抑制活性。

综上所述,对HDAC6及其选择性抑制剂的研究已取得了丰硕成果。但是,仍有许多制约选择性HDAC6抑制剂发展应用的问题有待解决。例如,HDAC6蛋 白晶体结构未知; HDAC6的底物众多,如何避免脱靶效应; 大多数已知的抑制剂是相对选择性或优先选择性的,如何获得真正选择性的抑制剂等。总之,HDAC6作为新型药物治疗靶点已引起人们广泛关注,其选择性抑制剂在多种疾病的治疗方面前景广阔。