布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂 (PRN

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投稿作者：许晓鸥

作者：Elizabeth C. Goodale, Katarina E. Varjonen, Catherine A. Outerbridge, Petra Bizikova ,Dori Borjesson, Dedee F. Murrell, Angelina Bisconte, Michelle Francesco, Ronald J. Hill, Mohammad Masjedizadeh, Philip Nunn, Steven G. Gourlay and Stephen D. White.

翻译：许晓鸥

校对：辛蕾

背景：布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)在B细胞信号转导中很重要。已报告BTK抑制剂(BTKi)在人类自体免疫性疾病中的疗效。犬落叶型天疱疮(cPF)是最常见的犬自体免疫性皮肤病。

目的：确定BTKi在cPF治疗中的安全性和疗效。

动物：9只家养犬。

方法和材料：对诊断为PF的9只犬给予BTKi PRN473。初始剂量为≈15mg/kg，每日一次，如果治疗疗效不佳，则增加至每日两次。治疗最长持续20周，并尝试减量为隔日一次。通过全血细胞计数、血清生化全套、尿液分析对犬进行监测，并使用经过验证的人类天疱疮疾病活动指数(cPDAI)的改良版本进行评估。在治疗期前后进行抗桥粒糖蛋白-1(DSC-1)和桥粒芯糖蛋白-1(DSG-1)免疫球蛋白G(IgG)滴度测定。在外周血单核细胞中测定与靶点结合的药物。

结果—在治疗的前两周，所有的犬（9只）均出现了病变区域的减少和cPDAI评分的降低。在研究结束时判断疗效， 有4例“良好”，2例“一般”，2例“较差”，1只犬因曾切除的肥大细胞瘤复发而退出研究。4只犬达到4周的持续改善；3只犬到研究结束时接近完全缓解。3只犬中的抗DSC-1 IgG滴度降低，2只犬中的抗DSC-1 IgG滴度升高，3只犬中未检测到，退出研究的犬未进行检测。所有犬均未检出DSG1的IgG。有3只犬发生了不良反应。

结论和临床重要性：在一些cPF病例中单独使用布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂治疗可能有较好的疗效。

1.简介

尽管犬落叶型天疱疮 (cPF) 是一种不常见的疾病，但其可能是犬最常见的自体免疫性皮肤病之一。这种疾病通常有两种表现形式：分布于头部、面部、耳廓和爪垫的初期结痂型脓疱病，或全身结痂型皮肤病，后者更常伴有全身性症状，如发热或嗜睡。其潜在机制被认为是II型免疫反应，由直接针对跨膜蛋白-桥粒糖蛋白-1(DSC-1)和（在少数犬）桥粒芯糖蛋白-1(DSG-1)介导。组织学通常表现为中性粒细胞性脓疱病。cPF的治疗一般采用糖皮质激素，常辅以其他免疫抑制药物如硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环孢菌素或麦考酚酯。所有这些药物均有不良反应，可能包括多尿、多饮、多食、骨髓抑制、肝毒性、糖尿病和感染易感性的增加。尽管较早的文献报道cPF的致死率高达60.5%，生存时间与治疗不良反应的数量呈负相关，但最近的报道显示死亡率低得多，可能是由于较新的皮质类固醇药物以及使用脉冲皮质类固醇方案所致。然而，寻找另外的对cPF安全有效的治疗方案是兽医皮肤病学的重要策略。

布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是人体健康中支持体液免疫的蛋白质。它首次出现在一种最终被命名为X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的疾病，该病由美国医生Ogden C. Bruton报道。BTK是一种由659个氨基酸组成的蛋白质，在B细胞发育和功能中发挥着重要作用，因为该酶可传递和放大多种表面分子的信号，并使其多元化，在B细胞受体信号转导和细胞迁移中发挥重要作用。BTK介导B细胞受体对抗原结合的应答以及通过CD40、toll样受体、Fc受体和趋化因子受体对刺激的应答。自体反应性B细胞比正常B细胞更依赖于BTK存活，当不存在BTK时，总抗体水平维持不变情况下自体抗体会减少。

在小鼠实验中，转基因BTK过度表达引起系统性红斑狼疮样疾病，而25%正常水平的BTK表达减少了自体抗体的产生，并消除了自体免疫综合征。所有供试种属（啮齿类动物、犬、非人灵长类动物和人）的BTK蛋白序列比对的同源性为99%。

布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)药物通过抑制非T细胞白细胞（包括B细胞、中性粒细胞和肥大细胞）中的BTK，减少B细胞受体以及B细胞和其他非T细胞白细胞上FCcR（表面IgG受体）的下游信号转导来发挥作用。这些药物降低外周B细胞成长为成熟外周B细胞的能力，从而干扰该细胞的增殖、分化和存活。研究显示，BTKis对人和犬的一些B细胞恶性肿瘤均有效。已报道两种不同的BTKi分子对人类天疱疮（主要是寻常型变体）和多发性硬化有效。有几种BTKi分子正在开发或临床试验中。

PRN473是由原理生物制药(美国，加利福尼亚州，南部旧金山，原理生物制药有限公司) 开发的一种新型试验用BTKi。发现其在人体中口服吸收较差，但在犬中吸收良好。PRN473是一种可逆性共价BTK抑制剂，选择性结合BTK，靶点停留时间长，全身清除快。在使用全长重组BTK的动力学竞争试验中，PRN473的BTK停留时间延长>200h，在大鼠外周血单核细胞(PBMC)中>24h，通过具有快速全身清除的细胞测定，BTK的缓慢解离速率导致具有较长的作用持续时间和较好的疗效，同时降低脱靶毒性的可能。PRN473通过抑制巨噬细胞抗原-1信号转导抑制中性粒细胞募集，并在自体免疫性疾病动物实验如大鼠胶原诱导的关节炎(CIA)的实验中证实了疗效。

在本研究之前，PRN473已在健康比格犬中进行了广泛的毒理学试验，包括原理生物制药进行的一项12周极高剂量药物非临床研究质量管理规范(GLP)研究。在该研究中，使用≤400mg/kg/d剂量时，仅观察到活动减少和体重减轻，尤其是在雌性动物中。该研究中雄性动物未观察到不良反应的剂量(NOEAL)为400mg/kg，雌性动物为120mg/kg。（未观察到不良反应剂量，No Observed Adverse Effect Level (NOEAL)：指外源化学物在一定时间内按一定方式或途径与机体接触后，根据目前认识水平，用最灵敏的试验方法和观察指标，未能观察到对机体造成任何损害作用或使机体出现异常反应的最高剂量。）

由于上述BTK在B细胞信号转导、自体抗体产生和PRN473抑制中性粒细胞募集能力中的重要性，我们推断BTKi可有效治疗cPF。本研究的主要目的是确定在自然发生PF的犬中的疗效和安全性。次要目的是评价治疗期前后的抗DSC-1和抗DSG-1 IgG滴度血清水平的所有变化；推断随着B细胞信号转导减少，产生的抗DSC-1和抗DSG-1 IgG将减少。

2.方法和材料

2.1 研究设计和动物

这是一项初探性、非盲研究；方案获得了加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会以及临床试验审查委员会的批准，并遵循其指导原则（方案编号18353）。

入选标准：如果符合以下标准，则将犬纳入研究：(i)符合角质层下脓疱病的临床特征（脓疱、浅层糜烂和结痂）；(ii)组织学证实为角质层下脓疱性皮炎伴棘层松解；(iii)组织病理学评估和/或真菌培养显示高碘酸希夫（过碘酸希夫反应）染色未见皮肤癣菌；(iv)适当抗生素治疗无改善或改善极小；(v)既往未接受过适当免疫抑制药物治疗或治疗失败。

排除标准：如果犬妊娠或患有活跃性全身性疾病（包括肿瘤形成），则将其排除。

2.2 实验过程

采血时间为0、4和24h；2、4、8、12、16和20周。通过颈静脉穿刺采集血液至8mL枸橼酸钠单核细胞玻璃制备管（真空单核细胞制备管采血管；美国新泽西州富兰克林湖；BD医疗）中，用于外周血单核细胞（PBMC）分离。简言之，血液在室温下以1800g不间断离心20min。收集PBMC，并用250g磷酸盐缓冲液（PBS）（美国纽约格兰德岛；GIBCO公司）清洗两次，持续5min。取出等份PBMC，计数(美国佛罗里达州海厄利亚；贝克曼库尔特AcTDiff细胞计数仪 ) 并用抗CD21抗体（克隆CA2.1D6，白细胞抗原生物学实验室；美国加州大学戴维斯分校）标记，随后用驴抗小鼠Ig-PE (Jackson ImmunoResearch实验室；美国宾夕法尼亚州西格里夫) 检测B细胞。在配有CXP软件的FC500流式细胞仪（计数仪）上读取标记细胞。使用FLOWJO软件 (美国俄勒冈州亚什兰集团) 测定淋巴细胞群中B细胞的百分比。剩余PBMCs用缓冲、浓缩(910)氯化铵裂解试剂(美国BD医疗BD PharmLyseTM裂解缓冲液)处理，沉淀、速冻并储存在-80℃下，直至分析BTK占有率。

采用硼-二吡咯亚甲基（荧光）标记的BTK探针，在竞争试验中测定BTK结合率（PBMC中与PRN473结合的BTK酶的百分比），统一为总BTK，并计算处理样本中结合探针相对于给药前PBMC样本的比值。探针标记的PBMC蛋白组分在变性凝胶上通过电泳分离；探针和总BTK通过图像扫描进行硼-二吡咯亚甲基荧光和总BTK定量。在每次采血时进行这些分析。

本研究中使用的所有体外试剂均在犬样本中进行了交叉反应性检测，并证实具有与其他种属相似的反应性。本研究中使用的BTK探针PRN933和BTK检测抗体（克隆53，BD生物科学；美国加州圣何塞）与先前啮齿类动物和犬研究中使用和发表的抗体相同，原理生物制药报告可选择性检测所有种属的BTK。PRN933是使用先前发表的结构在内部合成的，并验证了其与这些结果具有/相似的结合亲和力。

DSC-1和DSG-1的IgG滴度测定如前所述。按照1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200检测所有血清，记录最后一次阳性稀释度。在每只犬给药期之前和结束时，测定Desmocollin-1和DSG-1 (IgG)滴度。

2.3 药物治疗

PRN473是100mg片剂。剂量为每日15mg/kg，与食物同服。与食物同服时，该药剂量基于啮齿类动物和比格犬的临床前研究结果。如果研究者认为治疗2-4周后犬的病变未缓解，或如果认为BTK结合率数据低于最佳水平，则剂量可加倍。如果根据下文判断犬的反应良好，则在12周后尝试降至每隔一天一次，治疗维持16-20周。

2.4 监测

通过全血细胞计数(CBC)、血清生化检查和尿液分析对犬进行监测。使用经过验证的犬改良版的人类天疱疮疾病活动指数（cPDAI；图S1）对其进行半定量评估。改良包括重新命名（用爪子代替脚）或犬的特定解剖结构（包括鼻平面、口周和尾部）。治疗结束时，定性评估犬对治疗的反应为良好（>90%的病变在单独药物治疗时完全缓解）、一般（≥50%的病变缓解，但需要皮质类固醇）或较差（前两周后病变无缓解，随后需要传统药物干预）。将疗效较差或出现需要中止治疗的不良反应的犬从临床试验中移除。

在接受PRN473的第2、4、8、12、16和20周对犬进行监测/评估。由两名不了解对方评分和结果平均值的兽医通过cPDAI进行评估。

2.5 统计学评估

使用Wilcoxon秩和检验确定疗效与BTKi中位占用率（4和24h）以及抗DSC-1滴度之间的相关性。P /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端