『流式protocol』用PI、7

流式细胞术检测时，死细胞非常容易导致非特异性染色，引起结果不正确，所以排除死细胞很关键，更详细的解读请参见以前发过的两篇文章：

死细胞的鉴别一般通过DNA结合染料排除，利用死细胞膜通透性增大、不破膜的情况下DNA染料即可进入的特点区分出死细胞，但所用染料浓度、时间远远低于细胞周期所用的浓度，并且不需要固定。

常用的核酸结合死活鉴别染料包括：

碘化丙啶（propidium iodide，PI）

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）

7-氨基 - 放线菌素D（7-amino-actinomycin D ，7-AAD）

DRAQ7

SYTOX

不过对于一些胞内抗原（细胞因子、转录因子），由于需要固定、破膜，所以上述染料中，除了一些胺类染料（如Live/Dead、Ghost等）和新型蒽醌类染料CyTRAK Orange外，其它染料不再适合此类标本的细胞死活鉴别。

这里，只向大家讲解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法，其它商品化死活染料请按照说明书操作：

1. 用0.5ml 1×PBS重悬细胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，终浓度分别为PI（5 µg/ml）、DAPI（500-1000 ng/ml）、7-AAD（2.5 µM）

3. 加入上述染料后，尽快上机，一般不要超过5分钟（有些厂家说明书写着10分钟，可能与浓度有关，可按照说明书操作）。

PI检测通道：使用488 nm激发，用610/20 BP收集

DAPI检测通道：最好用355nm激发，用440/40BP收集；也可以用405nm激发，450/50BP收集

7-AAD检测通道：用488nm激发，用670/14BP收集

下图是用PI检测细胞死活的结果图：

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