抗体药介导NK细胞进行ADCC的检测

ADCC

抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)是单克隆抗体药物（mAbs）的主要作用机制之一。这种免疫反应依赖于单克隆抗体的双重活性：抗体由Fab 专一性识别靶细胞（肿瘤细胞/病毒细胞）表达的抗原，而Fc与效应细胞表面的Fc受体（FcRs）结合。NK细胞是能发挥ADCC作用的主要效应细胞。在抗体介导的ADCC作用发生过程中，抗体Fab与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞经由CD16（FcγRIIIa）结合抗体Fc，可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞。故抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，NK细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。

抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

活化后的NK细胞可经由三种作用途径对靶细胞进行毒杀:

◆穿孔素、颗粒酶作用途径穿孔素 (Perforin)是储存于胞浆颗粒内的细胞毒性物质。在含有钙离子的条件下，可在靶细胞膜上形成孔洞，使水电解质迅速进入胞内，导致细胞崩解破坏。颗粒酶 (Granzymes)就是丝氨酸蛋白酶，可循穿孔素在靶细胞膜上形成的 “孔洞” 进入胞内，通过激活凋亡相关机制导致靶细胞死亡。

◆Fas与FasL作用途径 活化的NK细胞表面可表达FasL，当FasL与靶细胞表面的相应受体Fas（CD94）结合后，可在靶细胞表面形成Fas三聚体，从而使其胞浆内的死亡结构域相聚成簇，后者与Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）结合，进而通过动员并激活caspase8，通过caspase级联反应，最终导致靶细胞死亡。

◆TNF-α与TNFR-I作用途径TNF-α与FasL的作用类似，它们与靶细胞表面的相应受体（TNFR-I）结合后，可使之形成TNF-R三聚体，从而导致胞浆内的死亡结构域相聚成簇，募集死亡结构域蛋白（FADD）结合，进而通过动员召集并激活caspase8，最终使细胞死亡。

ADCC 检测方法

由以上细胞间作用可知，ADCC整个过程有三个重要组成部分：单抗药物、效应细胞（NK细胞）和靶细胞。因此，体外实验一般包括靶细胞的确定（细胞表面高表达单抗识别抗原）、效应细胞的选择和靶细胞活性的检测。

靶细胞的确定: 抗体药物研发或临床试验中所靶向的肿瘤细胞或被病毒感染的细胞。

效应细胞的选择: 一般检测多使用供者的外周血单核细胞 (PBMC)。或自ATCC购买使用NK92细胞株。或使用基因工程改造细胞稳定表达FcγRIIIa受体，和由NFAT应答元件(response elements）驱动表达的luciferase报告基因检测方法 (ADCC reporter bioassay) 。抗体与效应细胞表面的受体结合后，激发细胞内NFAT反应元件，继而驱动荧光素酶 (luciferase)的表达。荧光素酶活性可以通过生物发光进行定量。采用这种方法简单方便，然而该体系不能反应抗体在体内的真实作用。

为获得更精准的实验数据，使用NK细胞即能真实反映抗体对靶细胞进行ADCC。NK 细胞可使用MACSxpress Whole Blood NK Cell Isolation Kit, human(130-098-185)自全血分离。或使用CD56 microbeads 自Buffy coat或LRSC分离NK细胞。抑或利用NK Cell Isolation Kit, human (130-092-657) 自PBMC进一步分离NK 细胞。

自buffy coat使用CD56 MicroBead Kit分离NK细胞，

利用MACSQuant® Analyzer分析分选富集后的细胞组分

靶细胞活性检测:

（1）铬51(51Cr) 标记/释放法 (Chromium release assay) 是检测ADCC最为经典的方法。将具有放射性的铬51与靶细胞孵育，铬51会进入靶细胞；洗去多于未进入细胞的铬51，再将靶细胞和效应细胞以及抗体共同孵育。如果靶细胞被杀伤，铬51就会被释放出来，检测溶液中的放射性同位素含量即可确认靶细胞被杀伤的情况。该方法是ADCC检测靶细胞被杀伤的金标准，然而因为带有放射性元素、费时费力且实验变化性大。因此有非放射性的检测方法被相继开发出来。

Principle of the chromium release assay

抗CD20的单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab – anti-CD20)ADCC assay

（效应细胞: NK 细胞 ；靶细胞: Raji cell line – B cell lymphoma）

（2）细胞毒性测试 (Cytotoxicity assay) 利用类似铬51的原理但使用荧光的方法来检测靶细胞的死亡，如calcein-AM本身没有荧光且很容易地进入活细胞，进入活细胞后就变身成强荧光的calcein，若细胞被杀伤，荧光信号就可以在胞外被检测到。类似的还有使用比色或荧光测定LDH或GAPDH活性的释放。此方法可用于高通量快速筛选并获得实验同质性高的结果，然而效应细胞自身也会裂解导致高背景值的讯号产出。

Calcein-AM release assay

（3）CFSE(carboxy fluorescein succinimidyl ester) cell viability assay此为利用双重染料：CFSE标记靶细胞，FVD标记死细胞，以流式细胞术来定量ADCC杀伤靶细胞的方法。此方法以多参数方法进行检测，操作简单并可获得可信的实验结果。

CFSE 标记细胞

以上几种方法皆是根据细胞膜的完整性来判别靶细胞是否被杀伤。然而一般通用检测细胞活力的MTT assay、WST assay却不能取代以上检测方法，毕竟ADCC反应中不光有靶细胞还有效应细胞，而效应细胞数量往往是靶细胞的很多倍，它们的活力状态也会干扰对结果的判断。

此外，效应细胞的选择也关乎到实验数据的可靠性；使用NK细胞作为效应细胞才能真实地反映抗体对靶细胞进行ADCC的细胞毒杀作用。

美天旎提供多种途径分离富集NK细胞

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