3T3

2023-12-09 09:50| 来源: 网络整理| 查看: 265

制备培养基

培养基必须在无菌条件下于组织培养罩中制备。MDI（甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基应现配现用。

制备 MDI 诱导培养基

在 DMSO 中制备 IBMX (50 mM) 和地塞米松 (1 mM) 的储备液。如果使用冻干胰岛素，请根据制造商说明复水。在 DMEM 中加入 IBMX 至终浓度为 0.5 mM（每 100 mL 培养基加入 1 mL IBMX 储备液）加入地塞米松至终浓度为 1 μM（每 100 mL 培养基加入 100 μL 地塞米松储备液）加入胰岛素至终浓度为 10 µg/mL

制备胰岛素培养基

在 DMEM 中加入胰岛素至最终浓度为 10 µg/mL

3T3-L1 细胞分化为脂肪细胞样细胞在 6 孔板中接种细胞，接种密度为每平方厘米 3 x 103 个细胞。让细胞在 DMEM 中生长至汇合度为 70%，每 2 - 3 天更换一次培养基。分化前，汇合度不应超过 70%，因为这样会增加分化后的细胞死亡。开始分化时，去除 DMEM，并在每个孔内加入 2–3 mL MDI 诱导培养基（第 0 天）。第 3 天，去除细胞中的 MDI 诱导培养基，更换为 2–3 mL 胰岛素培养基。第 6 天，去除细胞中的胰岛素培养基，加入新鲜的 DMEM。到第 7-10 天，应获得完全分化的脂肪细胞样细胞。

分化为脂肪细胞样细胞的过程可以通过油红 O 染色追踪，以便监测脂质积累情况，也可以通过监测脂肪细胞标志物（如脂联素和 FABP4）的表达追踪。

实验方案改编自 Reed BC, Lane D (1980). Insulin receptor synthesis and turnover in differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 285–289

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