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图一：IL-1 beta靶点蛋白结构。图片来源：SWISS-MODEL。IL-1 beta靶点介绍蛋白功能蛋白表达蛋白定位异构体 & 翻译后修饰WB实验贴士注意事项阳性对照阴性对照结果示例关键控制点参考文献IL-1 beta靶点介绍蛋白功能 IL-1β是由许多不同类型的免疫和非免疫细胞，在迅速响应炎症信号后产生和释放的。 大多数IL-1家族成员的生物发生与其他细胞因子的不同之处在于，大多数白介素IL-1是以非生物活性的酶原形式产生，然后经蛋白水解的成活性形式。髓系细胞中IL-1β(和IL-18)的N端加工是由炎症小体的效应成分caspases完成。 IL1β的产生分两步进行，每一步都受到不同刺激的调控。首先，炎症信号，如LPS，刺激pro-IL1β的合成，并促进其在细胞质储存积累。然后炎症小体组装需要额外的信号，导致CASP1激活，pro-IL1β加工，并最终以活性细胞因子形式分泌。 IL-1β通过与TNF和IL6协同诱导VEGF的产生，在血管生成中发挥作用。 蛋白表达IL-1β在活化的单核细胞/巨噬细胞中表达(蛋白水平)。 IL-1β被LPS刺激表达。在巨噬细胞中的转录和翻译，IL-1β可被结核分枝杆菌和多种不同结核分枝杆菌组分刺激，其中EsxA是实验过最有效的激活子(在蛋白质水平)。在胰岛组织中，高糖治疗增加IL-1β的释放。在胰岛和巨噬细胞中，endocannabinoid anandamide/AEA也增加IL-1β的释放。 蛋白定位细胞质，溶酶体，外泌体，分泌。 前体在细胞质定位，响应炎性小体激活信号后，如NLRP3炎性小体的ATP或NLRC4炎性小体的细菌鞭毛蛋白，被切割并分泌。 图二：IL-1β靶点ICC实验结果图，Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]产品(ab254360)。绿色：IL-1β，红色：alpha Tubulin，蓝色：DAPI。异构体 & 翻译后修饰人（P01584）：30.7 kDa（预测） 小鼠（P10749）：30.9 kDa（预测） 大鼠（Q63264）：30.6 kDa（预测） IL-1β前体的激活涉及CASP1催化的蛋白水解。加工和分泌是暂时相关的。 回到顶部WB实验贴士 注意事项IL-1β的前体pro-IL-1β在31 kDa左右，刺激后约266个氨基酸的pro-IL-1β前体被切割成约153个氨基酸的IL-1β成熟形式的。 IL-1β不是组成型表达的，IL-1β无论是IL-1β的前体还是成熟体，可能都需要刺激才能检测到，例如在使用ab254360检测RAW264.7细胞中的IL-1β时，需用100 ng/ml LPS处理7小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理RAW 264.7细胞才能获得阳性信号；此外，刺激的强度和类型影响IL-1β的剪切和分泌，并且不同的产品其要求的刺激强度也可能不同。建议参考具体产品说明书。另外可以选择多个产品一起验证诱导条件，或者用同一通路靶点比如IL-1 alpha抗体一起检测，确保诱导条件是合适的。 IL-1β是分泌型蛋白，建议使用抑制分泌试剂（例如Brefeldin A）处理细胞，抑制IL-1β分泌到细胞外；或者检测培养细胞上清。 IL-1 beta 在种属间的同源性不是很高，例如人源IL-1β与小鼠来源IL-1β有67%同源性，与大鼠来源IL-1β有66%同源性，因此在选择产品时，建议优先选择免疫原与待测样品同源的产品。 IL-1β在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，以确认实验体系没有问题。 阳性对照100 ng/ml LPS处理7小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理的RAW 264.7全细胞裂解液。 80 nM TPA过夜处理，然后100 ng/ml LPS处理6小时，并在最后3小时加入Brefeldin A处理的THP-1全细胞裂解液。 阴性对照(无表达或弱表达)未处理的RAW 264.7全细胞裂解液 未处理的THP-1全细胞裂解液 结果示例图三：WB- Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]产品（ab254360）。一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]一抗，浓度1/1000稀释。泳道1：未处理的RAW 264.7全细胞裂解液；泳道2：100 ng/ml LPS处理7小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理的RAW 264.7全细胞裂解液；泳道3：未处理的THP-1全细胞裂解液；泳道4：80 nM TPA过夜处理，然后100 ng/ml LPS处理6小时，并在最后3小时加入Brefeldin A处理的THP-1全细胞裂解液；二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/50000稀释。预测条带大小：31 kDa检测条带大小：31/28/17.5 kDa注意：IL-1 beta的表达需要LPS诱导。31 kDa条带是precursor IL-1 beta，28 kDa条带和17.5 kDa条带是蛋白水解的IL-1 beta。图四：WB-Anti-IL-1 beta antibody [EPR21086]产品（ab216995）。一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR21086]一抗，浓度1/1000稀释。泳道1：未处理的THP-1全细胞裂解液；泳道2：100 ng/ml Lipopolysaccharide (LPS)处理3小时的THP-1全细胞裂解液。二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/100000稀释。预测条带大小：31 kDa图五：WB- Anti-IL-1 beta antibody [EPR16805-15]产品（ab234437）。一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR16805-15]一抗，浓度1/1000稀释。泳道1：未处理的RAW 264.7全细胞裂解液；泳道2：100 ng/ml LPS处理6小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理的RAW 264.7全细胞裂解液。二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/100000稀释。预测条带大小：31 kDa检测条带大小：31/28/17 kDa关键控制点在实验中除了需要注意常规问题外，还要特别关注以下关键控制点： 样本制备 添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。 整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。 建议使用阳性和阴性对照。 电泳 至少上样20μg总蛋白进行电泳。 对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量 |
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