3T3

1、.首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买 的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是 1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普

2、通培基）。这 是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。一般说不能超过20代，最好在10代以内。诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存 用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液 终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。DEX： 分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液 终浓度为1umol/L,即每100ml培养液

3、加40ul储存液。可用2年。Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml 终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1) 将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37、5CO2培养;2) 待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L)DEX和终浓度为10ug/ml的胰岛

4、素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3) 48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化812天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。诱导操作注意事项：1、 一共需诱导3次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h，若时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h。2、 诱导操作需注意：以6孔板为例，每孔3ml培液，一个6孔板需18ml培液，则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul（储存液），DEX7.2u

5、l储存液，胰岛素108ul（储存液）。第一遍诱导时用200ul的移液枪先每孔加200ul配制好的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细胞会飘起来，俗称卷边。每孔加5遍200ul培液，合计1ml，第二、三遍则每孔1000ul加培液，方法同上，操作要慢、轻。3、 第2次诱导时，诱导剂的配制为：18ml培液，加胰岛素108ul（储存液），混匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第3次诱导诱导仅需换10%高糖DMEM培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培液看起来就黄了。4、 第三次诱导以后，

6、可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次1ml的培液换，一般换液2天后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。细胞是否诱导成功细胞代数很重要，我们这边一般是13代以后的细胞就很难诱导出来了，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。3T3-L1细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI诱 导，DMEM高糖+胎牛血清），第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin诱导，DMEM高糖+胎牛血清），细胞中 就可以观察到脂肪

7、滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定浓度的KOH溶解 的，insulin是在一定浓度的HCL中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为3T3-L1细胞，但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入 分化诱导的时候，一定不能用胎牛血清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小心被污染！祝各位实验顺利！共同学 习！因为3T3-L1加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管 家的时候很难控制流速，力度大。用枪头

8、加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的 话，还是能用，没有什么大的影响，如果范围比较大的话最好重新诱导。你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX大家一般都是用 0.5mmol/L，胰岛素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性的吗？因为一般 的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。镜下观察细胞接 触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起了，如果你的

9、细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。 这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自 己需要自己摸索一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1长得非常快，如果长满以后不换液，会有大批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在10*4数量级，这样让细胞长3天后铺满，再换液，再让细胞长 2-3天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest状态。2，IB

10、MX的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH溶液都可，针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的insulin，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化。我用的方法是美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细),现发给各位战友共享,呵呵.如果不能成功分化的话,只能质疑细胞的问题了.3T3-L1 Differen

11、tiation ProtocolMATERIALSDulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um f

12、ilter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium

13、 Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe fi

14、lter. Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and

15、store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passa

16、ge:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (70%), if you want to continue to passage them and differe

17、ntiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need. Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM 2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Ins