ANKRD基因家族在骨骼肌纤维类型转换中的作用研究

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作者：

胡瀚洋

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摘要：

哺乳动物骨骼肌纤维类型是影响肌肉品质的重要因素,同时,肌纤维类型的转换也与肌肉生长发育,分化以及骨骼肌重塑关系密切.尽管近年来对肌纤维类型的发生和转换有许多研究,但是对与控制肌纤维类型发生和转换的基因或调控因子的分子机理尚未研究透彻.因此,鉴定出对肌纤维类型转换起关键作用的基因对于从分子水平上认识肌纤维类型转换的机理具有重要意义. ANKRD(ankyrin repeat domain)家族的两个成员ANKRD1和ANKRD2在心肌和骨骼肌特异表达,并且在不同类型肌纤维中差异表达,都与维持肌纤维形态与结构,调节细胞增殖和分化有关,因而推断它们可能参与了肌纤维类型转换的调节.因此,本研究从ANKRD基因家族入手,利用慢病毒表达载体和RNAi相结合技术,对ANKRD基因家族对肌纤维类型转换的作用作了初步研究,取得了如下结果: 1.利用GENEBANK数据库,得到小鼠和猪的ANKRD1,ANKRD2基因的结构信息,克隆了CDS全长,其中猪和小鼠ANKRD1为960bp,ANKRD2为987bp. 2.利用TOPO克隆技术成功构建了小鼠和猪ANKRD1, ANKRD2的四个pENTR-TOPO载体;之后利用Gateway亚克隆技术,构建了小鼠和猪ANKRD1, ANKRD2的四个慢病毒表达载体. 3.利用ViraPower HiPerform慢病毒表达系统,将小鼠ANKRD1, ANKRD2慢病毒载体包装成病毒. 4.慢病毒感染C2C12细胞后,real-time QPCR检测目标基因的表达量以及慢肌特异表达基因TN1表达量变化.结果显示感染C2C12后,mANKRD2的表达量上升了405倍,并且TNI的表达量下调了3.5倍. 5.利用化学合成Stealth siRNA方法制备小鼠ANKRD1,ANKRD2 siRNA序列,转染C2C12细胞,半定量RT-PCR筛选两个基因有效siRNA序列. 6.将两条有效siRNA及阴性对照StealthTM RNAi negative control HIGH GC分别转染C2C12细胞,real-time QPCR检测目标基因的表达量以及慢肌特异表达基因TN1和快肌特异表达基因MCK表达量变化.结果显示干扰后,小鼠mANKRD1表达量下降了5倍,TN1的表达量下调了7倍;小鼠mANKRD2表达量下降了3倍,TN1表达量上调了60%.但无论干扰mANKRD1还是mANKRD2, MCK的表达均无明显变化.

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关键词：

ANKRD；肌纤维类型；慢病毒；siRNA

学位级别：

硕士

DOI：

CNKI:CDMD:2.1010.010902