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小鼠饲养繁育

2023-09-13 00:31| 来源: 网络整理| 查看: 265

由于基因表达和调控的复杂性和多样性，客户获得小鼠模型后，在大量扩繁前，应先对模型中目的基因的敲除 / 表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。检测结果确认后，再进行大量的扩繁及表型实验等。

1、PCR 假阴性（扩增条带弱或无条带）

特征： 样品目的条带无法扩增或条带弱。 阳性对照同样没有条带或条带极弱。 原因： 目的片段条带过大导致扩增效率低。 未完全重复我方扩增体系（酶、DNA 提取、程序等）。 PCR 仪温控模块差异。 解决方式： 设计备用引物，尽量缩短 PCR 产物大小。 完全按照我们的体系来进行鉴定。 由于仪器、操作等环节依然存在变量，若上述处理无法改善，建议梯度测试最优退火温度。

2、PCR 假阴性（泳道弥散状、伴随核酸挂孔现象）

特征： 胶孔大量发光，DNA 无法脱离胶孔。 泳道出现弥散状抹带，通常伴随挂孔现象。 原因： DNA 通过碱裂解、一步法试剂盒提取，未经纯化使用，蛋白裹在核酸上，导致核酸无法跑出胶孔。 DNA 模板附着较多杂质，影响引物的退火结合。 弥散的泳道通常为一些降解的核酸片段。 解决方式： 稀释 DNA 模板，降低杂质比例。 重新纯化提取 DNA 模板（乙醇纯化、离心柱纯化等）。 及时电泳，避免扩增产物长时间存放室温或 4℃ 冰箱。

3、PCR 假阳性（出现污染）

特征： 阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带，通常会稍弱于阳性样品的主带，偶有与主带完全相同的亮度。 常发生于 PCR 产物小于 500bp 的反应中，产物越小，污染可能性越高。 原因： 样品交叉污染，包括 DNA 模板、扩增体系配置或者电泳时污染。 气溶胶污染，少量样品鉴定时偶发，大批量样品鉴定、或者长时间使用同一对引物鉴定时发生频率明显增高。 解决方式： 轻微污染时，提高退火温度、减少 3-5 循环、稀释 DNA 模板同时进行。 污染严重时，重新设计备用引物检测，条带不小于 500bp，同时使用上述调整体系。

4、PCR 特异性差（存在非特异性条带）

特征：

除目的条带外，存在其他特异性扩增的产物，有时非特异性产物与目的带接近，影响结果判定。

原因： 引物不特异； 酶的效率太强、退火温度偏低、退火延伸时间过长。 解决方式： 非特异性扩增条带较弱时，提高退火温度、减少 3-5 循环、稀释 DNA 模板同时进行，可有效抑制非特异性扩增。 非特异性扩增条带较强时（杂带亮度与目的带几乎一样或者更亮），重新设计 PCR 引物。

5、PCR 优势扩增

特征：

PCR 发生优势扩增，两条带的亮度不同，甚至可能有一条带完全无法扩增。

原因： 当一个 PCR 反应中存在超过一种产物时，不同的产物会存在竞争性扩增，导致其中一种产物的产量远大于其他产物。 通常小条带比大条带更容易扩增，且两条带差距越大，优势扩增现象越明显。 个别情况下，比如产物序列存在特殊结构，也会出现大条带优势扩增现象。 解决方式：

集萃药康鉴定方案为避免优势扩增干扰，通常两条带差距超过 300bp，会分别设计引物用于验证，避免优势扩增出现。

6、电泳条带弯曲

特征：

电泳结果出现「笑脸状条带」。

原因：

制备琼脂糖凝胶时，煮沸后部分水分蒸发，导致琼脂糖凝胶中的电泳液浓度，高于电泳槽中的电泳液浓度。此时胶孔中的 PCR 产物，中心区域迁移速率快，周围靠近电泳液的产物迁移速率慢，展现出严重的弯曲。

解决方式：

煮沸凝胶后，需要添加蒸馏水，补足蒸发的体积，需要注意缓慢添加，并同时均匀晃动，避免局部降温过快，导致凝胶冷却不均匀产生结块。



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