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mRNA技术自发现几十年来在大众视野中一直籍籍无名，然而伴随新冠疫情的到来mRNA技术与其疫苗逐渐崭露头角为众人所知，实现了从实验室到临床的突破。mRNA疫苗作为一种特殊的药物，通过在人体内表达目标蛋白起到特定效应。为保证mRNA稳定地表达，其序列结构优化、修饰和递送系统LNP的选择极为重要。其中5’-端加帽反应是一种必不可少的修饰过程，形成的帽结构有助于mRNA逃避细胞先天性免疫反应、实现体内有效的蛋白质翻译，是刺激机体应答的首要条件。

那么mRNA加帽的原理是怎样呢？在实验室或工业化的制备过程中，又是如何通过体外转录完成mRNA的加帽反应呢？我们一起了解下吧。

一、真核生物mRNA加帽反应原理

RNA聚合酶催化RNA的转录合成，这一过程中以DNA为模板；RNA聚合酶作用于DNA模板链的3’-端，RNA链从5’-端向3’-端延伸。转录的同时，mRNA的5’-端进行加帽反应，7-甲基鸟嘌呤通过5’-5’三磷酸键与mRNA的5’-端连接。根据甲基化修饰的程度不同分为3种帽结构：Cap 0、Cap 1和Cap 2。 

1.加帽过程

在RNA三磷酸酶作用下，mRNA 5’-端γ-磷酸基团被去除，生成5’-二磷酸RNA；

在鸟苷酸转移酶（guanylyl-transferase）作用下，GTP中的GMP基团与5’-二磷酸 RNA连接；在鸟嘌呤N-7甲基转移酶（guanine-N(7)-methyltransferase）作用下，鸟嘌呤的N7位发生甲基化（甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸[SAM]），形成帽结构Cap 0（m7GpppNpNp）。2.不同帽结构的形成

而后在2’-O核糖甲基转移酶（2' -o Ribose methyltransferase）作用下，mRNA第一个核苷酸的2’-O位发生甲基化，形成帽结构Cap 1（m7Gpppm2’NpNp）；mRNA第一个和第二个核苷酸的2’-O位均发生甲基化，形成帽结构Cap 2（m7Gpppm2’Npm2’Np）。

二、体外转录制备mRNA

体外转录制备mRNA，常见的加帽方法包括酶法加帽和共转录加帽。

‍1.酶法加帽（Enzymatic capping）

基于真核细胞内的加帽原理，酶法加帽反应以体外转录后产物、NTPs、SAM等为底物，利用牛痘病毒加帽酶（Vaccinia Capping Enzyme，VCE）可直接形成帽结构Cap 0。其中牛痘病毒加帽酶具有三种酶活性，包括RNA三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和鸟嘌呤N-7甲基转移酶；在2’-O-甲基转移酶的催化下，可进一步形成帽结构Cap 1或Cap 2。酶法加帽率接近100%，但由于反应过程依赖加帽酶和其他供体，且工艺流程繁琐，不利于工业化生产。 

2.共转录加帽（Cotranscribed capping）

基于大家对工艺便利性的需求，共转录加帽法应运而生，在体外转录反应体系中添加帽类似物，在转录起始引入帽类似物，转录完成即可获得带帽结构的mRNA，简化了工艺流程。时至今日，帽类似物的结构优化经历了3代变革，第2代帽类似物ARCA解决了反向加帽的问题；第3代帽类似物CleanCap可直接引入Cap 1，加帽率可达到90%以上。 

三、耀海在mRNA技术上的服务能力

1.预制品：在创新药蓬勃发展的大环境下，耀海生物搭建了“RNASci”mRNA科研级样品制备服务平台。基于酶法加帽和共转录加帽，耀海生物现已推出自主开发设计的科研级预制品mRNA-eGFP（增强绿色荧光蛋白）。为了验证mRNA-eGFP的表达效果，我们使用了一款常规脂质体转染试剂，向293细胞系中转染了mRNA，转染24小时后实现高水平的荧光表达，结果如下：

耀海生物现有mRNA预制品包括：新冠病毒mRNA疫苗（S蛋白）、mRNA-eGFP、mRNA-luciferase（细菌荧光素酶），可在3-7个工作日内完成交付（由于RNA稳定性不高，公司采用现货生产）。

2.定制化服务：

作为科研用mRNA定制合成行业的新星，耀海生物亦提供序列设计、转录模板制备、体外转录、mRNA纯化的一站式服务，制备工艺稳定，长度最高达9kb，耗时短，最快7个工作日内交付。

耀海生物将持续更新研发技术，优化制备工艺，更好地助推新药研发进程，为国内生物药的发展而蓄力！

参考文献：

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耀海生物，作为中国生物医药产业蓬勃发展的亲历者和见证者，深耕微生物表达体系CDMO服务多年，业务聚焦在“重组蛋白/多肽、质粒/mRNA、纳米抗体、新型重组疫苗”等领域，致力于打造CRO/CDMO/MAH开放式、全方位、一体化的产研服务平台。用心服务，共创未来。十年来，耀海生物坚持创新发展，坚定不移走在不断提高和完善研发、生产、质量管理与控制服务体系的道路上，以平台技术构筑实力底蕴，并以全面的服务能力、丰富的项目经验及规模领先优势，为国内外制药公司提供从工艺开发到商业化生产的全生命周期CDMO服务，助推客户新药项目顺利推进，为中国生物医药产业发展持续赋能。

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