鉴定新的植物特异性ATG8相互作用蛋白家族

为了确定其他ATI3蛋白是否也是ATG8相互作用蛋白，研究了拟南芥 ATI3B和ATI3C与酵母细胞中ATG8A和ATG8F的相互作用，结果表明，ATI3B和ATI3C也与ATG8A和ATG8F有强烈相互作用。

图1.酵母细胞中拟南芥ATI3和ATG8蛋白的相互作用

OsMFS1蛋白与OsHOP2相互作用

为了确定ATG8和ATI3是否在植物细胞中相互作用，我们在农杆菌浸润的烟草中进行了双分子荧光互补试验（BiFC ）。当融合的ATG8A-N-YFP与ATI3A-C-YFP在烟叶中共表达时，在转化细胞中检测到信号。结果表明，ATI3A与植物细胞中的ATG8A相互作用，并且这种相互作用取决于ATI3A的WxxL LIR基序。

图2.BiFC试验结果

ATI3基因的功能分析

为了确定蛋白质ATI3的生物学功能，分离为T-DNA插入突变体ATI3A。qRT-PCR分析检测到该突变体中ATI3A的转录本很少，表明它是基因敲除突变体。比较了野生型（WT）和ati3a突变体的衰老和黑暗诱导的衰老和耐盐性的差异，ati3a突变体没有发现显著变化。因此，ATI3A在某些受自噬影响的重要过程中似乎没有发挥关键作用。

进一步的分析表明，ati3a-1突变体的耐热性大大降低。这些结果表明，ATI3A在植物耐热性中起着关键作用，而这一作用取决于它与ATG8的相互作用。

图3. Atit3基因在耐热性中的功能分析

为了评估ATI3A与植物抗病性的关系，我们比较了ati3a-1和WT对真菌的抗性。结果表明，ATI3A在植物对真菌病原体的抗性中起关键作用，并且此作用还取决于其与ATG8的相互作用。

图4. Ati3基因在植物抗灰霉病中的功能分析

UBAC2作为ATI3A相互作用蛋白的鉴定

基于与ATG8蛋白的相互作用以及在植物耐热性和抗病性中的关键作用，植物ATI3蛋白可能充当选择性自噬受体，在植物胁迫反应期间靶向特定的细胞成分。为了深入了解ATI3的作用，使用酵母双杂交筛选鉴定与ATI3相互作用的蛋白质。为了确定ATI3A和UBAC2在植物细胞中是否相互作用，我们在农杆菌浸润的烟草中进行了BiFC。ATI3A和UBAC2之间的相互作用产生了大量的点状荧光信号。

图5. ati3-ubac2相互作用的BiFC分析

UBAC2蛋白靶向内质网

为了确定拟南芥 UBAC2的亚细胞定位，我们构建了UBAC2-GFP融合构建体，并与本氏烟草中的AT5G42020/BIP-mCherry-KDEL ER标记共表达。结果BIP-mCherry-KDEL的红色荧光信号以无数个网络形式出现在整个细胞中。该结果表明 拟南芥 UBAC2蛋白位于ER中。

图6. ubac2蛋白的亚细胞定位

UBAC2在植物耐热性和抗病性中的功能分析

为了确定UBAC2蛋白质的生物学功能，我们分离2T-DNA插入突变体UBAC2A和1T-DNA插入突变体UBAC2B。qRT-PCR分析显示，与WT中的突变体相比，这些突变体所含基因突变的转录物少于5％，因此很可能是敲除突变体。进一步研究表明，UBAC2A和UBAC2B是部分冗余的，而UBC2A在植物耐热性中起着相对重要的作用。

图7. ubac2在耐热性方面的功能分析

为了评估UBAC2与植物抗病性的关系，我们比较了ubac2突变体和野生型植物对病原体的抗性。与ATI3一样，UBAC2蛋白不仅在植物耐热性中而且在植物对病原体的抗性中都具有重要作用。

图8. Ubac2基因在植物抗灰霉病中的功能分析

由于UBAC2已参与ERAD，因此我们将ubac2a ubac2b双重突变体的表型与拟南芥 AT1G18260/HRD3A的T-DNA敲除突变体进行了比较。结果发现，ubac2a ubac2b和hrd3a突变体的表型没有完全重叠。

ati3和ubac2对ER应激的敏感性显著提高

ATI3和UBAC2可能介导了植物中在胁迫下靶向降解的选择性自噬途径。为了验证这种可能性，我们研究了ER胁迫下幼苗生长和存活，比较ati3a ati3b ati3c三突变体和ubac2a ubac2b双突变体对ER胁迫的耐受性。结果表明，ATI3和UBAC2基因的破坏导致对ER应激因子TM的敏感性大大提高。

图9. ati3和 ubac2突变体对ER应激的反应

ati3和 ubac2在自噬依赖性降解中的作用

为了进一步分析ATI3蛋白是否通过UBAC2受体作为选择性自噬受体，研究了由荧光标记的点状自噬体结构在叶液泡中的传递和积累。当使用BIP-GFP-KDEL蛋白作为ER标记进行检测时，ati3和ubac2突变体在ER胁迫下完全具有自噬和IRE1依赖性ER降解能力。

图10. ati3和 ubac2在ER应激诱导的自噬依赖性降解中的作用

自噬依赖的ATI3和UBAC2传递到液泡

如果ATI3和UBAC2蛋白介导针对特定降解的选择性自噬途径，则ATI3和UBAC2蛋白可能会作为自噬体的一部分传递到液泡中进行降解。为了测试这一点，我们研究了由ATI3A-GFP或UBAC2A-GFP标记的点状自噬样结构在ER胁迫下在叶片原生质体液泡中的传递和积累。结果表明，ATI3和UBAC2蛋白在ER应激下以自噬依赖性方式传递到液泡。

图11. ER应激下ATI3和UBAC2传递到液泡

结论

我们确定了一组新的双子叶植物特有的ATG8相互作用蛋白。遗传分析表明，ATI3和UBAC2基因在植物耐热性和对病原体的抗性中均起重要作用。ATI3和UBAC2蛋白可以介导新的选择性自噬途径，该途径在植物胁迫反应中起重要作用。但还需要进一步的实验来确定ER中ATI3和UBAC2介导的自噬途径的特定靶标，并研究植物胁迫反应期间自噬途径的调控。

该研究受到国家自然科学基金的资助。

参考文献

【1】Mizushima N. Autophagy. FEBS Lett. 2010;584:1279.

【3】Klionsky DJ. Autophagy. Curr Biol. 2005;15:R282–R283.

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