纪凤娣 1 ， 鲁 绯 1 ， 程永强 2

(1．北京一轻研究院食品与工业研究所，北京 101111;2．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

摘 要: 米曲霉是我国传统酱油生产用关键菌种．关于米曲霉菌株选育的研究主要包括，高产蛋白酶菌株选育技术研究、酶学特性研究、产酶影响因素研究等方面．高产蛋白酶菌株的选育为研究重点．虽然，研究均显示经过改良的菌株性能超过了原始出发菌株，但是成果仍然局限于实验室理论分析．我国科研人员仍需努力，加强对米曲霉菌株在工业化生产中实际应用效果的研究．

关键词: 酱油;米曲霉;选育;酶学特性;基因

米曲霉(Aspergillus oryzae)是我国传统发酵调味食品—酱油酿造用关键菌种．目前，我国80%以上的酱油生产企业，均采用米曲霉制曲，为后续发酵过程提供所需的各种酶系，如蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等．酱油的品质、生产效益等与酿造酱油用的米曲霉有十分密切的关系，因此，本文对我国酱油生产用米曲霉菌种的研究现状进行概述，为企业酱油产品质量的提高及工艺控制提供依据．

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形、项囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形平滑，少数有刺，适宜的培养温度为37℃．米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株．目前，我国酱油生产绝大多数采用沪酿3.042米曲霉制曲，其具有对营养要求较粗放、生长快、蛋白酶活力较高、产孢子量大、不产毒素等特点．已有研究表明 ［1－2］ ，在现有制曲条件下，其所产蛋白酶以中性和碱性蛋白酶为主，其他酶系不足，导致原料中各种成分如淀粉质原料不能完全被分解，风味不足．选育酱油酿造用新菌株，一直以来都是国内科研工作的热点．

通过各种方式诱变(紫外线、离子注入法、原生质体融合、微波)获得性能优良的菌株是普遍采用的方法．早在30多年前，科学工作者就对米曲霉沪酿3.042进行了纯化复壮，挑选出蛋白酶活力高、生长快、易管理、原料利用率高的菌种，但这仍无法满足酱油生产发展的需要．

大量科研人员对高产蛋白酶米曲霉菌株筛选进行了研究．有研究采用紫外线、氯化锂和硫酸二乙脂(DES)复合诱变方法，以米曲霉M-2为出发菌株，筛选得到酸性蛋白酶高产突变株 ［3］ ．利用紫外线、高温、亚硝酸单独或复合处理，以米曲霉A.oryzae-I为出发菌株，得到的突变株蛋白酶活力比原始菌株提高了33.12% ［4］ ．以自选米曲霉为出发菌株，采用紫外线诱变筛选出的突变株蛋白酶活力提高了1.47倍 ［5］ ．以米曲霉l-7.3为出发菌株，通过紫外诱变，结合含有不同制霉菌素药物浓度的PDA培养基，得到了酸性蛋白酶和中性蛋白酶活分别提高了230.10和17.5%的突变株 ［6］ ．以酱油酿造用菌粉为出发菌，经紫外线诱变及控温培养处理后，获得遗传稳定性较好的变异菌株，酶活力提高了77.84% ［7］ ．以沪酿3.042为出发菌株经过快中子、钴60、Y射线、紫外线、甲基磺酸乙酯(EMS)、氯化锂等交替诱变育种，筛选出新菌株UE336-2米曲霉．其应用于生产种曲孢子数可达5×10 9 个/g以上，接种量0.4% ～0.5%，成曲中性蛋白酶活力比对照菌提高70% ～100%，其他酶系相仿 ［8］ ．利用紫外线诱变筛选出高产纤维素酶米曲霉菌株，突变株纤维素酶活力是原始株的1.84倍 ［9］ ．以野生米曲霉K61进行紫外诱变，筛选出蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29，性能优越的米曲霉沪酿3.042菌株 ［10］ ．以沪酿3.042为出发菌株，经紫外诱变与化学诱变，筛选得到变异菌株蛋白酶活性比原菌株提高了110%，耐温性能较强，遗传稳定性较好 ［11］ ．

采用传统的物理、化学方法筛选菌株，劳动量巨大，诱变率低．随着新的诱变技术的产生，显著提高了菌株的诱变率．有报道以沪酿3.042米曲霉原生质体制备，利用经过分生孢子的原生质体紫外线－氯化锂、NTG复合诱变得到 8株突变株 ［12］ ．潘力等 ［13］ 利用原生质体，进行多亲株双灭活PEG介导融合，获得一株融合菌株FII4l，酶活力比出发株提高1.76倍，且遗传稳定．王华等 ［14］ 采用高压诱变技术对米曲霉菌株进行处理，得到了蛋白酶及淀粉酶活性显著提高的菌株．

虽然对酱油生产用微生物米曲霉进行诱变选育的研究报道众多，并且大都获得了性能优良的新菌株，但是，目前并没有应用于生产获得成功的报道．

碳源、氮源、初始pH值及温度等均能影响米曲霉所产酶系及酶活．胡学智等 ［15］ 发现无机氮、拌水率、无机盐均能促进米曲霉3.042产酶，提高大豆蛋白的消化率．杨世平等 ［16］ 则得到麸皮:豆粕粉=4∶1，水的质量分数为60%，最佳培养温度为30℃，最佳培养时间为48 h为产中性蛋白酶的适宜培养条件．邓靖等 ［17］ 研究表明麸皮∶葡萄糖∶水 =9∶1∶5，接种3 mL孢子菌悬液，28℃培养72 h时酶活最高．李秀婷等 ［18］ 研究认为产酶的最佳碳、氮源分别为麸皮及蛋白胨，最适初始pH值为6.0～8.0，温度为30℃．刘晓蓉等 ［19］ 研究结果表明，豆粕含量20%，NaCl浓度2%，初始pH6.6，接种量3‰，31℃培养108 h，淀粉酶活最大．张艳芳等 ［20］ 用米曲霉40188制曲最佳时间为50～72 h，中性蛋白酶及a-淀粉酶最高．林祖申 ［8］ 筛选出新菌株UE336-2米曲霉，28 h制曲酿制酱油全氮利用率平均提高7.1%．傅力等 ［21］ 报道米曲霉菌株UF366最适的制曲培养基为豆粕∶麸皮∶水 =6∶4∶5，培养温度 33 ℃，培养时间32 h，翻曲2次，接种量4‰可得到最高的蛋白酶活．

酱油的产生是在各种酶系的作用下将原料中的蛋白质、淀粉、纤维素等成分降解而形成．因此，酱油的品质与酿造酱油用米曲霉所产酶系的性质有十分密切的关系．

酱油生产中最注重原料利用率的高低，因此，蛋白酶活性高是米曲霉菌株必须具备的一个重要特性．一直以来，中性蛋白酶活作为一个重要指标用于指导生产，但是，研究发现，酸性蛋白酶对原料中蛋白质的降解及风味的形成也发挥着重要的作用．近年来，对于米曲霉菌株所产蛋白酶酶学特性的研究开始活跃，随着对不同菌株酶学特性研究的深入，为指导实际生产提供了有力的支持．

党敏娜等 ［22］ 研究发现食盐对不同米曲霉菌株所产中性蛋白酶活力的影响不同，在实际酱油发酵中的盐浓度下测定中性蛋白酶活力才能更客观、准确地反映菌种最适合生产实际使用．汤鸣强等 ［23］ 研究表明，米曲霉F-81产中性蛋白酶最适作用温度为60℃，Cu 2+ 、Fe 3+ 强烈抑制酶活性．张淑娟等 ［24］ 分析发现米曲霉令野菌株产蛋白酶最适温度为40℃，40℃保温5 h，剩余酶活力为54%，NaCl对其有非竞争性抑制作用．李艳丽等 ［25］ 发现米曲霉ZW-06产中性蛋白酶，最适温度45℃，最适作用pH为6.5和9.0，Mg 2+ ，Mn 2+ 和 Ca 2+ 对蛋白酶有强烈的激活作用，Fe 2+ 和Cu 2+ 有强烈抑制作用．林祖申 ［8］ 对米曲霉菌株UE336-2所产蛋白酶研究表明，最适pH值为6～9，最适温度50℃，但失活较快，在含有食盐7%左右、温度40℃ ～45℃为宜．米曲霉40188产中性蛋白酶，最适pH分别为7～8，中性蛋白酶酶活随着盐浓度的增加呈下降趋势 ［20］ ．最近，研究发现 ［26－27］ ，酱油成曲中含有不同分子量大小的蛋白酶，分别作用于蛋白质的不同位点，这一发现，为更具有针对性地提高酱油生产技术，提供了理论支持．

近年来，人们开始意识到淀粉酶对酱油风味的形成有重要贡献，有研究指出酱油成曲中至少有4种不同分子量的淀粉酶组分，其中活性最高的淀粉酶组分分子质量是52 000 u，为a-淀粉酶，最适pH值6.2，最适温度为 50 ℃ ［28］ ．刘晓蓉等 ［19］ 对米曲霉1228产a-淀粉酶研究发现，该酶最适温度为55℃，最适pH 值为 5.0，Ca 2+ 对酶有激活作用，Fe 2+ 、Fe 3+ 、Mn 2+ 、Ba 2+ 和Cu 2+ 对其有不同程度的抑制．张艳芳等 ［20］ 对米曲霉40188产a-淀粉酶的研究表明，最适pH 6～8，酶活在40℃稳定，热稳定性较强，耐盐性较强．

新技术的不断涌现，为我们获得性能优良的菌株提供了越来越有力的支撑，虽然，已有研究获得了很多性能优良的新菌株，遗憾的是至今未见成功应用于生产的报道．日本已经通过基因组比较及转录分析发现了米曲霉对原料的有效降解机制 ［29］ ．我国科研人员仍需努力，进一步探讨米曲霉菌株的基因与产品质量的关系．

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(责任编辑:王 宽)

Study on Aspergillus Oryzae Breeding in Production of Chinese Traditional Soy Sauce

JI Feng-di 1 ， LU Fei 1 ， CHENG Yong-qiang 2 (1．Department of Food and Industrial Technology，Beijing Industrial Technology Research Institute，Beijing 101111，China;2．College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Abstract: Aspergillus oryzae is the key organism in production of traditional soy sauce．The research of Aspergillus oryzae breeding included the strain breeding of high productivity of protease，enzyme characteristic，and conditions of enzymes producing，focusing on the strains of high productivity of protease．Though these studies have shown that the strain performance was improved comparing the original strain，the research was still limited to laboratory theoretical analysis．The application of Aspergillus oryzae in industrial production of soy sauce need further exploration．

Key words: soy sauce;Aspergillus oryzae;breeding;enzyme characteristic;gene

中图分类号: TS201.2

文献标志码: A

文章编号: 1671-1513(2012)04-0041-03

收稿日期: 2012-04-16

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31171738)．

作者简介: 纪凤娣，女，副研究员，博士，主要从事食品发酵技术方面的研究．