本发明涉及植物分子育种领域，具体涉及一种蝴蝶兰成花相关基因phpif4的制备及其应用。

背景技术：

1、蝴蝶兰是兰科蝴蝶兰属植物的统称，其花型如蝶，姿态优美，花色丰富，花期长，具有“洋兰皇后”的美誉，是国际上销量最大的畅销高档盆栽花卉，也是我国销售量最大的年宵花卉，在花卉产业占据着举足轻重的地位。蝴蝶兰年宵期间价格具有时段性，过年后蝴蝶兰价格降至1/3，多数企业每年都会有大量的蝴蝶兰因花期错过春节，价值大幅降低，甚至需要剪掉花梗，再增加一年的养护费用，严重影响经济效益。蝴蝶兰花期调控技术，不仅影响开花质量和等级，也直接决定了蝴蝶兰年宵花上市时间。蝴蝶兰不同品种花期不同，早花品种和晚花品种花期相差1个多月。‘大辣椒’(phalaenopsis'big chilli')是我国蝴蝶兰市场上深红色大花型的主流品种，约占市场份额的50％，该品种存在花期较晚的缺点，错过年宵上市时间会导致巨大经济损失，因此蝴蝶兰的成花调控尤为重要。

2、目前对蝴蝶兰成花已经展开了部分研究，但是这些研究基本都集中在蝴蝶兰的生产和栽培技术方面，激素、低温、长日照和成熟度是蝴蝶兰花芽分化的主要诱导因子，说明蝴蝶兰成花过程是一个由多途径、多基因参与的复杂网络。生长调节剂赤霉素可用于花期调控，使花期提前，促进蝴蝶兰花梗伸长。为了阐释蝴蝶兰成花调控的分子机理，利用rna-seq法，对测序数据分析了蝴蝶兰‘大辣椒’成花转变和花发育过程中差异表达的28339个基因，从中挖掘了蝴蝶兰成花过程中生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸信号转导途径中的差异表达的关键基因，并通过加权基因共表达网络分析挖掘了涉及响应外界环境因子如光照和温度、同时能响应激素调节的关键基因pif4。通过荧光定量pcr验证了转录组筛选的8个与开花相关的degs，筛选挖掘了phpif4基因进一步探究其响应ga的表达情况，结果表明，phpif4与蝴蝶兰花发育过程紧密相关，随着花发育进程其表达量逐渐加倍。喷施生长调节剂ga3后，phpif4基因在花芽、叶和根中的表达量均显著增加，且在现蕾期增加量最大，表明phpif4基因的表达可能受ga3影响与调控，参与了ga促进成花的分子调控途径，为进一步完善蝴蝶兰成花调控机制和蝴蝶兰花期调控技术的推广应用奠定了理论基础。

3、随着生活水平的提高，观赏花卉越来越受到人们的关注，研究蝴蝶兰成花调控机制具有广泛的应用前景。因此本领域技术人员致力于寻找参与和决定蝴蝶兰成花调控的基因及其应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种用于调控蝴蝶兰成花的基因序列及其应用，所述基因序列可以影响蝴蝶兰成花转变和花发育，从而获得具有早花多花性状的蝴蝶兰。

2、为实现上述目的，本发明采用一下技术方案：

3、一种用于调控‘大辣椒’蝴蝶兰成花的基因基因序列，包括以下核苷酸序列中的一种或多种：

4、1)seq id no.1所示的核苷酸序列；

5、2)seq id no.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；

6、3)与seq id no.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。

7、本发明还提供了一种氨基酸序列，其能影响蝴蝶兰成花的基因，包括以下氨基酸序列中的一种或多种：

8、1)seq id no.2所示的氨基酸序列；

9、2)seq id no.2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、或添加衍生产生的氨基酸序列；

10、3)与seq id no.2具有至少80％同源性的氨基酸序列。

11、本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种蝴蝶兰phpif4基因的制备方法，包括以下步骤：

12、(1)提取蝴蝶兰叶片中的dna；

13、(2)根据权利要求1中蝴蝶兰phpif4的基因序列，设计特异引物phpif4-f，phpif4-r，然后以dna模板进行pcr扩增，得到cdna全长序列；其中，

14、phpif4-f序列如seq.id.no.3所示，

15、phpif4-r序列如seq.id.no.4所示；

16、(3)pcr产物进行回收、载体连接、转化，测序得到phpif4基因编码区序列，phpif4基因的开放阅读框(open reading frame,orf)为531bp，编码176个氨基酸。

17、进一步，步骤(3)中，所述pcr扩增反应体系为：nuclease-free water 20μl，biorun pfu pcr mix 25μl，primer(+)(100μm)2μl，primer(-)(100μm)2μl，template 1μl，total volum50μl。pcr反应程序为94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸32s，进行30个循环；72℃充分延伸10min，16℃30min。

18、本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是，一种蝴蝶兰phpif4基因在转基因拟南芥中的应用，利用强启动子(花椰菜花叶病毒35s启动子)驱动原理的转基因技术，将phpif4基因的过量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因拟南芥植株。实验证明，超量表达phpif4基因的转基因拟南芥花期提前，花量增多，说明phpif4基因在植株成花中发挥重要作用。

19、综上，本发明从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中分离克隆出的成花相关基因完整编码区段的dna片段，验证该基因功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株成花能力明显提高。通过植物基因工程技术改善植物成花有益生产性状，为蝴蝶兰定向育种提供了重要基础。

技术特征：

1.一种蝴蝶兰成花基因phpif4的制备及其应用方法，其特征在于，所述成花基因phpif4的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蝴蝶兰成花基因phpif4的核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蝴蝶兰成花基因phpif4的制备步骤为提取蝴蝶兰花芽叶片的dna；根据权利要求1中蝴蝶兰phpif4的基因序列，设计特异引物phpif4-f，phpif4-r，然后以dna模板进行pcr扩增，得到cdna全长序列，其中，phpif4-f序列如seq.id.no.3所示，phpif4-r序列如seq.id.no.4所示；pcr产物进行回收、载体连接、转化，测序获得phpif4基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增反应体系为nuclease-freewater 20μl，biorun pfu pcr mix 25μl，primer(+)(100μm)2μl，primer(-)(100μm)2μl，template 1μl，total volum 50μl。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr反应程序为94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸32s，进行30个循环；72℃充分延伸10min；16℃30min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蝴蝶兰成花基因phpif4的应用为蝴蝶兰成花基因phpif4在转基因拟南芥中的应用。

技术研发人员：张英杰,张京伟,郭文姣,孙纪霞,丁朋松,赵玲玲,刘述河受保护的技术使用者：山东省烟台市农业科学研究院技术研发日：技术公布日：2024/7/11