上一章我们在linux桌面上创建了个名为00_raw_data文件夹，并将所有原始数据拷贝到了文件夹中，接下来的操作需要通过终端指令完成。

（1）通过cd Desktop/00_raw_data/切换到原始数据文件下。 （2）输入ls -lh查看当前文件夹下所有文件的详细信息，如下图所示。 注：为了方便后续的显示和操作，我这里只拷贝了两个原始文件。 （3）准备样本信息文件，输入指令：ls -lh > sample_info，这时你能发现会多出来一个sample_info的文件。 （4）输入：vim sample_info打开文件，文件信息如下图所示。 （5）键盘上点一下字母i（为了开始编辑模式），删除第一行和最后一行的内容，处理后的数据如下图所示一共是9列。 （6）处理后，先点一下键盘上Esc，之后输入:wq即可保存退出。

（1）保存好样本信息后，接下来做质控，回到终端，输入：fastqc A2_1.fq.gz，软件就会开始对样本做质量分析，分析过程如下图所示。

（2）运行结束后当前目录下会出现两个文件：一个是html文件，一个是zip压缩包，这里我们重点关注html文件（因为html文件里存有质控的结果信息）。 （3）打开linux左侧收藏栏中文件资源管理器 （4）逐层找到00_raw_dara文件夹中的html文件，双击就可打开查看质控结果（能打开是因为ubantu自带火狐浏览器，也可以拖拽到宿主机中再查看） 注：质控结果的分析可以参考质控结果分析1，质控结果分析2。

刚才我们通过fastqc A2_1.fq.gz指令输出了一个样本的质控信息，但是我们一共有12个样本，为了节省时间，需要写一个脚本让系统自动运行。（这一步就会用到第一步准备好的样本信息表）

（1）第一步创建的sample_info文件中第9列是所有样本的名称。

（2）输入指令：awk '{print "fastqc "$9}' sample_info > fastqc_run.sh这段指令的意思：仅提取sample_info文件第9列，并在每一行前面加上fastqc，最后输出结果为fastqc_run.sh脚本。

（3）cat fastqc_run.sh查看脚本，如下图所示每一行都是：

（4）最后通过bash fastqc_run.sh指令执行脚本，这时系统就开始一行一行执行代码，直到最后一个样本被分析完。

注：脚本执行后应该会产生大量的html文件和zip文件，如果感兴趣的小伙伴可以一一通过生成的html文件查看每个样本的质量分析结果。

通过指令multiqc .对当前目录下所有质控结果合并，正常运行过程如下图所示。 指令运行结束后会在当前目录下输出一个名为multiqc_data的文件夹和一个名为multiqc_report.html的网页，重点关注multiqc_report.html文件，查看方式同步骤二。

General Statistics——所有样本数据基本情况统计 %Dups——重复reads的比例，比例越高代表重复reads数量就越多，有用的reads就少。 %GC——GC含量占总碱基的比例，比例越小越好 M Seqs——总测序量（单位：millions）

这里可以每个样本重复reads比例，鼠标移到每一个柱子上时会显示每个样本的比例，黑色代表重复的reads，蓝色表示没有重复的reads。

每个read各位置碱基的平均测序质量

具有平均质量分数的reads的数量

表示每个样本各位置碱基ATCG的比例，一般前一段ATCG比例会有波动，属于正常情况

reads的平均GC含量 正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线

每条reads各位置N碱基含量比例 当不能辨别reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生一个N，所以N值越大就表明未知碱基越多 好的样本N值应该如图所示，N值很小，基本为0。

序列长度分布 这里主要显示测序长度和read counts的对应关系，我这里12个样本测序长度是150bp，对应的read counts基本都在15000000~20000000。

序列的相对重复水平 序列重复水平分布是统计序列完全一样的Reads的频率，通过该指标可以提示我们测序过程产生的偏差

理想情况应该是左侧非常高，往右越低越好，趋于直线，如上图，就代表序列相对重复较高。

注：最后这两个值一般都没什么问题，但是接头含量要注意，下一步质量过滤的时候会去除接头。

如果我们拿到的原始数据含有接头或数据质量不好，就需要先进行数据过滤后才能进行后续分析。

数据过滤要用到的软件是trim-galore

首先，我们要了解trim-galore的参数（我这里只介绍部分会用到的参数，如果对全部参数感兴趣，可以自行百度或在linux终端下通过trim_galore -help指令查看。）

在linux系统桌面下首先要通过指令mkdir 02_clean_data创建一个文件夹名为02_clean_data（需要提前创建好输出文件夹，否则会报错），之后通过cd 00_raw_data切换到存放原始数据的文件夹目录下，开始样本质量过滤

我这里设定的quality是25，代表质量小于25会被剔除；stringency参数是1，代表对接头种重叠碱基数检查非常严格，如果接头中重叠碱基数大于1在后面的分析报告中就会显示出来；length参数我设定的是50，表明reads长度小于50的会被弃去；paired表明是双端测序；output_dir输出路径是桌面上的02_clean_data文件夹，质量过滤的结果会保存到这个文件夹中，最后两个是传入的原始文件，因为是双端测序，所以需要上传两个文件。

注：这一步比较慢，运行结束后，02_clean_data文件夹下会生成四个文件，XXX.fq.gz是过滤后的文件，XXX.txt是质量过滤的结果报告，打开XXX.txt文件，如下图所示是质量过滤结果的详细报告。 我们可以看到质量过滤结果的详细信息 （1）代表的是质量分数阈值，前面代码设置的是25，这里自然就是25，表示质量小于25的都会被去除。 （2）可以忍受的前后接头重叠的碱基数，由于参数设定的是1，所以这里显示的是1bp。 （3）表示输出reads长度阈值，参数设定的是50，代表长度小于50的reads都会被去除。 （4）完成质量过滤所消耗的时间。 （5）表示接头重叠碱基数大于1的reads，我这里显示有36.4%的reads接头重叠碱基数大于1。 （6）最后一个表示质量小于25的占有0.3%，自然，这一部分会被去除（如果quality参数设的越大，这个值就会越大）。

结语：

以上就是质控及数据过滤的所有过程，如果有什么需要补充或不懂的地方，大家可以私聊我或者在下方评论。

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