招式一：读懂流式图

科研人员都知道，在各大期刊上都会出现流式图，无论是否做流式实验，流式图都会出现。那么究竟应该如何解读流式图呢？

我们先了解几个最简单的。

A.双参数图：根据每个事件的双参数值绘制x和y维度

1.前向/侧向散点图

常见的散点图横纵轴分别为FSC与SSC，分别代表细胞的前向和侧向参数，反映的是细胞大小和内容物的多少（如下图所示）。不同细胞的“物理”状态是不同的，且大小不一。而细胞质的复杂程度与功能密切相关，所以不同的细胞才会有不同的形态，有的大而丰富，有的小而紧凑。散点图就像细胞的一面“镜子”，不同细胞在这面“镜子”中呈现出了不同的大小和胞内物质的复杂程度。

通常在流式操作过程中，最开始都会生成FSC-SSC图（如下图所示）来观察细胞群的物理性质，通过该图可以圈出研究人员感兴趣的细胞群，在后续操作中完成进一步分析。

2.单荧光-侧向图

如下图所示，主要用于白血病分型以及区分细胞死活。

3.荧光强度图

如下图图所示，不带有红/绿两个荧光的细胞就会被分在Q3，就是两种荧光强度都很低的细胞群，也就是“阴性细胞群”；那么相应的，第一象限Q1中的点就代表两种荧光强度都很高的“双阳性”细胞群（同时带有红/绿）亮色荧光。

剩下的两个象限中的点的含义也就不言而喻了，是单荧光标记的“单阳”细胞群。

荧光强度散点图在实际操作中最为常见，通过观察两种荧光染色的细胞分布，判断双阳/单阳比例，从而进一步圈出需要研究的细胞群体。

上图所示，是三幅是实际应用图，最左侧图是前向-侧向图，根据细胞的大小和颗粒程度来区分细胞；中间图是单荧光-侧向图，可以查看单一荧光在细胞上的表达情况；最右侧图为双色萤光图。

4.等高线图

“等高线图”的横纵坐标是两种荧光的荧光强度（如下图所示），这种类型的图其实和单参数散点图很相似，相同密度的细胞会用线连在一起。

等高线图常用在地理上用于标记相同海拔高度的地点，而流式的等高线图展现的是一个细胞群里面细胞的聚集情况，越聚集的地方线会越密，代表了在此横纵坐标荧光强度中细胞是高度聚集的。

“等高线图”主要用于突出显示散点图中，距离的比较近的，不容易区分的细胞群。例如上图中右侧图，红色箭头所指的是Treg细胞群。用左侧的散点图不易看出的Treg细胞群，在右侧等高线图中一目了然.

5.密度图

而密度图，则可以形象理解为“天气预报”。

颜色越红代表细胞密度越大，密度图也有很大的用武之地，可以显示细胞群体的整体密度分布。

双参数图内容小结：

散点图显示的是“细胞的数量”（如下图所示），密度图和等高线图展示的是数据集中在哪里。对于稀少的事件，可以利用等高线图的轮廓来展示。

B.单参数直方图：最常见的直方图的横纵坐标分别为荧光强度和Count（细胞数目）

一个细胞所发射出的荧光信号强弱实际取决于它细胞抗原的多少，也就是抗原多的细胞，携带的能结合该种抗原的荧光抗体就越多，它就越亮。

上图两座“山峰”中，右侧“山峰”代表相对高表达FITC荧光的细胞数目；左侧“山峰”代表相对低表达FITC荧光的细胞数目。”

直方图其实就是细胞携带某一种荧光多少的一张图，荧光强度高代表该群细胞携带结合该种荧光抗体的抗原多。

*直方图通常用于表达荧光强度或者在数据叠加分析时，用于判断差异。

C.N维图

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事实上，读懂流式图只是进入流式武林的第一步，但却是极为重要的一步。作为一个“流式新生”，读懂流式图将有助于开展后续的研究操作，例如阅读文献、设计实验方案等。

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*所有流式图必须先看横纵轴的标记

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