HLA-Ⅰ类分子(human lymphocyte antigen classⅠmolecules) 是由高度多态性的重链跨膜糖蛋白(heavy chain, HC) 和β2微球蛋白(beta 2-microglobulin, β2m) 组成的异源二聚体[1]。内源性抗原经抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs) 处理后，产生与HLA-I类分子结合的抗原肽(又称抗原CTL表位肽)，通过APCs的抗原递呈作用，被CD8+ T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR) 特异性识别，诱导形成细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 克隆产生免疫应答[2]。HLA-I类分子HC的α1和α2结构域形成抗原肽结合槽，抗原肽结合槽底部有6个小袋状凹陷(A→F pocket)，其中A pocket和F pocket上的保守氨基酸与多肽N末端氨基和C末端羧基形成氢键，对结合的抗原肽起到固定作用[3]。同一等位型的HLA-I类分子通过识别多肽序列上特定的锚定氨基酸残基(anchor amino acid residues)，可以结合多种抗原肽[4]。筛选不同肽与HLA-I类分子相互作用形成HLA-I类分子/抗原肽复合物(peptide/HLA, pHLA) 的研究有助于发现新抗原CTL表位肽，对于阐明CD8+ T细胞特异免疫识别机制、研制多肽疫苗及发展特异性细胞免疫治疗都具有重要意义[5-6]。而且在pHLA基础上发展的HLA四聚体技术也能为CTL的特异性检测与研究提供更直接、有效的方法[7]。

获得pHLA复合物的常用方法是分别重组表达HC和β2m，在复性缓冲液中结合抗原肽。然而pHLA复合物的人工复性过程受复性缓冲液体系包括HC、β2m、抗原肽的摩尔数之比、pH值、温度以及电解质条件的影响，容易造成复性效果不易控制、耗时长，且容易形成HC二聚体和极度不稳定的空载HLA分子[8-9]。所以在其制备过程中需要对制备产物进行检测以优化复性条件，促进HC、β2m的正确折叠及与抗原肽之间相互作用形成pHLA复合物。此外由于HLA的高度多态性，不同型别的HLA-I类分子又可通过识别多肽基序结合多种抗原肽，理论上可形成无数种pHLA复合物。筛选与HLA-I类分子相互作用的抗原肽、研究pHLA复合物生物学功能、或者探索pHLA复合物制备条件，往往采用少量的复性缓冲液制备体系，不仅成本低而且易于操作。

目前验证制备pHLA复合物成功与否的常用方法有Western blotting、ELISA以及层析分离技术等方法。使用HLA-I类分子构象特异性抗体W6/32进行Western blotting、ELISA等方法是验证少量制备pHLA复合物成功与否的最常用方法，其中W6/32是抗HLA-I类分子的单克隆构象抗体，能识别HC、β2m折叠后与抗原肽结合形成HC-α2区的特定表位，与单独的β2m不能结合，与单独的HC仅有极微弱结合[10]。但基于构象特异性抗体W6/32进行Western blotting、ELISA等方法只能定性检测pHLA复合物是否形成，并不能定量检测pHLA复合物中结合的抗原肽。而且有研究表明体外稀释复性获得的pHLA复合物可能具有不同的构象，但具有相同的生物学活性[11]。这种构象差异有可能无法被构象特异性抗体W6/32特异性识别而导致鉴定结果具有不确定性，因此检测pHLA复合物还需要寻找其他方法，尤其是制备条件探索过程中对少量制备产物的检测鉴定。HLA-A*24是亚洲人群最常见的HLA等位基因之一[12]，且与HLA-A24超型具有高度同源性, 90%的HLA-A24属于HLA-A*2402亚型，因此本研究选择HLA-A*2402型基因来重组表达HLA-I类分子的HC、β2m及融合蛋白β2m/HC，并制备pHLA复合物。然后将超滤法与高效液相色谱法结合应用到pHLA复合物形成的检测，建立一种超滤-高效液相色谱法(超滤-HPLC) 用来定量检测少量的重组pHLA复合物中的抗原肽，从而鉴定pHLA复合物的形成。

含HLA-A*2402 HC、β2m及β2m-HLA- A*2402 HC重组表达质粒的大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3) 菌株为本实验室前期构建；HLA-A*2402限制性的人黑色素瘤相关抗原肽gp100-intron 4 (氨基酸序列为NH2-VYFFLPDHL-COOH，简称VYF抗原肽)和NH2-IRAWVAWRNR-COOH (简称IRA肽)由杭州固拓生物科技有限公司合成，纯度均大于98%；单克隆抗体W6/32购自Abcam公司；BioBasic™ 18 LC色谱柱购于赛默飞世尔科技(中国) 有限公司；HPLC Grade乙腈购于Spectrum Chemical；HPLC Grade三氟乙酸购于上海麦克林生化科技有限公司。

主要仪器与设备：LC-10AT高效液相色泵(日本岛津)；SPD-20A高效液相检测器(日本岛津)；超滤离心管(Millipore, MWCO: 3 kDa)。

HLA-A*2402分子提呈的抗原肽的第二位锚定残基分别为酪氨酸及苯丙氨酸，C末端锚定残基分别为苯丙氨酸及亮氨酸[13]，因此本研究选择含对应锚定残基的VYF抗原肽作为结合肽，不含锚定残基的IRA肽作为不结合肽。

对含有重组表达质粒的E. coli BL21 (DE3)菌株分别进行诱导表达。挑取单菌落至卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37 ℃过夜振荡培养。然后将菌液1︰100接种于新鲜的培养基中，37 ℃振荡培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L开始诱导表达。诱导表达5 h后，离心收集菌体沉淀。菌体沉淀用预冷的PBS重悬，超声破碎，离心获得包涵体蛋白。包涵体蛋白溶解于8 mol/L尿素溶液中，利用Ni-NTA亲和层析介质进行纯化，纯化结束后利用超滤脱盐法去除蛋白溶液中的高浓度咪唑，蛋白定量后–80 ℃冻存备用。

HPLC采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1% TFA乙腈溶液：0.1% TFA水溶液为31︰69，为流动相，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为214 nm。对复性缓冲液、VYF抗原肽的复性缓冲液和IRA肽复性缓冲液按照上述条件进行检测，确定VYF抗原肽和IRA肽的特征峰。精确配制浓度分别为0、2、3、4、5、6、7、8、9 μg/mL的VYF抗原肽和IRA肽的溶液，依次进行HPLC测定。以峰面积为纵坐标，肽浓度(μg/mL) 为横坐标，绘制标准曲线。配制2 μg/mL肽标准品溶液按上述色谱条件进行多次检测，记录峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)，验证该方法的精密性。另将VYF抗原肽和IRA肽分别配制成1、5、9 μg/mL浓度的标准溶液，一组实验取20 μL标准溶液进样检测，另外一组实验将标准溶液超滤后取滤出液20 μL进行HPLC检测，根据检测结果计算超滤后肽的回收率。

将HC、β2m、VYF抗原肽(摩尔数比例为1︰2︰10) 按照稀释复性的方法制备pHLA复合物[14]。将20 μg VYF抗原肽加至预冷的2 mL复性缓冲液中，10 ℃高速振荡混匀30 min，然后快速滴加50 μg的β2m，10 ℃高速振荡混匀1 h，最后分3次加入60 μg的HC，每次间隔12 h，10 ℃振荡复性至复性结束。同时设置HC和VYF抗原肽及β2m和VYF抗原肽为对照组。另外使用IRA肽作为不结合对照肽，进行同样的复性过程。融合蛋白β2m/HC、VYF抗原肽(摩尔数比例为1︰10) 复性制备pHLA复合物，不需要加入β2m，其他步骤同上。

使用1% BSA溶液对截留分子量为3 kDa的超滤管进行过夜钝化。各组复性产物分别进行第一次超滤，然后用复性缓冲液补足至500 μL，轻轻吹打混匀后再次超滤，重复3次以除去游离肽。取HC、β2m分别与VYF抗原肽及IRA肽复性折叠产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上后，依次与一抗W6/32及二抗反应，显色并观察结果[15]。向超滤后得到的pHLA复合物制备产物中加入3%三氟乙酸溶液补足至100 μL，静置20 min，通过低pH破坏HLA分子与抗原肽之间的相互作用[16]，再次超滤收集滤出液，并取滤出液20 μL进行HPLC检测。

为进一步优化制备条件，改变复性缓冲液的pH值和改变复性体系中抗原肽的浓度(复性体系pH分别设置为8.0、7.5及7.0，抗原肽浓度分别为5、10、20、40 μg/mL)，分别将HC、β2m、VYF抗原肽和融合蛋白β2m/HC、VYF抗原肽按照1.5中的稀释复性方法制备pHLA复合物，按上述超滤-HPLC法检测pHLA复合物中抗原肽的结合量，比较不同pH和不同肽浓度对pHLA复合物肽结合量的影响。

经IPTG诱导作用，HLA-A*2402 HC、β2m及β2m-HC在E. coli BL21 (DE3) 中大量表达。表达菌菌体经过超声破碎和反复洗涤后，得到以包涵体的形式存在的大量重组蛋白。用高浓度的尿素溶液溶解包涵体沉淀并进行Ni-NTA亲和层析纯化，分别用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱得到了高纯度重组蛋白：HLA-A*2402 HC、β2m及β2m-HC (图 1)。

HPLC检测结果显示，VYF抗原肽的复性缓冲液在14–15 min有特征吸收峰(图 2A)，因此选择14–15 min的吸收峰为VYF抗原肽；IRA肽在8–9 min有特征吸收峰(图 2B)。

在0–9 μg/mL范围内，VYF抗原肽和IRA肽标准曲线线性良好(图 3)，回归方程分别为：y=13.031 0x，R2=0.996 3；y=9.491 3x，R2=0.992 1。

精密性结果显示，VYF抗原肽和IRA肽的保留时间和峰面积RSD均小于2% (表 1)，方法精密性良好。

VYF抗原肽超滤回收率为96.91%–98.14%，IRA肽超滤回收率为95.10%–98.48% (表 2)。实验结果表明，超滤法具有较好的回收率，可以用来测定VYF抗原肽和IRA肽与HLA分子的相互作用。

在复性缓冲液中重组HLA-I类分子的重链HC与轻链β2m复性折叠，与含锚定残基的抗原肽VYF产生相互作用而形成pHLA复合物，经超滤去除未结合的游离抗原肽VYF而保留复合物，最后将pHLA复合物经酸性缓冲液处理破坏其相互作用从而释放抗原肽，再超滤收集VYF抗原肽进行HPLC检测，所测得的抗原肽VYF量即为重组HLA-I类分子与抗原肽相互作用所结合抗原肽的量。由于IRA肽不含锚定残基，因此不能与HLA-1类分子结合。结果显示HC、β2m和VYF抗原共复性制备的pHLA复合物中结合的VYF抗原肽浓度显著高于其余几组(P < 0.01) (图 4)。Western blotting结果也显示，结合VYF抗原肽的pHLA复合物可被HLA-I分子构象特异性抗体W6/32识别(图 5)，说明重组HLA-I类分子结合VYF抗原肽形成正确折叠构象，可鉴定pHLA复合物存在。同时超滤-HPLC法也可检测到pHLA复合物中含有抗原肽VYF，说明将超滤-HPLC法用于检测抗原肽与HLA-I类分子结合形成pHLA复合物的方法可行。

对制备pHLA复合物的复性条件进行优化，在复性缓冲液pH 7.0–pH 8.0范围内，HC、β2m、VYF抗原肽制备的pHLA复合物中VYF抗原肽的含量随着pH降低而下降，但β2m/HC、VYF抗原肽制备的pHLA复合物中VYF抗原肽的含量随着pH降低而上升。在复性体系中提高抗原肽的浓度，检测所制备的pHLA复合物中VYF抗原肽的含量均随之上升，当抗原肽浓度由5 μg/mL增加至20 μg/mL时，所制备的pHLA复合物中VYF抗原肽的检测吸收峰面积显著性上升(P < 0.01)；但抗原肽浓度从20 μg/mL增加至40 μg/mL时，所制备的pHLA复合物中VYF抗原肽吸收峰面积变化差异不明显(图 6)。

根据检测VYF抗原肽浓度可计算pHLA复合物的制备率，即制备率=HLA分子结合的抗原肽摩尔数/复性体系中总HLA重链蛋白摩尔数×100%。在上述复性条件范围内，HC、β2m、VYF抗原肽制备的pHLA复合物的最佳复性条件为pH 8.0、添加肽浓度为20 μg/mL，其抗原肽结合量为0.259 μg，对应摩尔数为0.225 nmol，即获得pHLA复合物为0.225 nmol，其制备率约为14.6%；β2m/HC融合蛋白与VYF抗原肽制备的pHLA复合物的最佳复性条件为pH 7.0、添加肽浓度为20 μg/mL，其抗原肽结合量为0.490 μg，对应摩尔数为0.426 nmol，即折叠复性获得0.426 nmol抗原肽-HLA复合体，其制备率约为36.9%。由图 7可知，β2m/HC融合蛋白与VYF抗原肽制备pHLA复合物的制备率显著高于HC、β2m与抗原肽形成复合物的制备率(P < 0.01)。

HLA-I类分子与抗原肽的相互作用是CTL细胞特异性识别靶细胞的分子基础。利用重组HLA-I类分子在复性体系中正确折叠并与抗原肽结合制备pHLA复合物，可用于研究人工APC刺激CTL细胞的特异性分化，以及开发特异性四聚体探针应用于CTL细胞特异性分化细胞群的检测。虽然通过改变蛋白体外稀释折叠复性条件、优化表位肽序列[17]、应用dtSCT技术[18]等为促进HLA-I类分子结合抗原肽、提高pHLA复合物制备效率方面提供改进方案，但是在制备条件探索过程中对少量制备产物的检测鉴定仍需要一种有效检测方法。尽管传统方法使用HLA-I分子构象特异性抗体W6/32进行Western blotting可以用于验证pHLA制备是否成功，但此方法只是定性检测pHLA复合物，并不能定量检测pHLA复合物中结合的抗原肽量，无法计算pHLA复合物的制备率。由于复性体系的条件变化影响pHLA复合物形成，要实现对pHLA复合物制备过程的质量控制就需要一种可以定量检测形成复合物中肽含量的技术，这样可以根据pHLA结合肽量的变化来优化复性条件，以提高pHLA的制备效率。本研究所建立的超滤-HPLC法用于检测pHLA复合物中的抗原肽，所测得的抗原肽即为重组HLA-I类分子结合的抗原肽，这为解决少量制备pHLA复合物的检测鉴定提供一种有效方法。在本方法中，第一次超滤步骤是去除未结合的游离抗原肽，第2次超滤是收集pHLA复合物经酸处理破坏其相互作用从而释放抗原肽并用于检测，两次超滤的目的不同。

随着对HLA-I类分子与抗原肽相互作用的深入研究，预测结果为低亲和力的多肽可能具有激发相应表位特异性CTL的潜能[17]。理论上HLA-I类分子与肽的亲和力低到一定程度时，pMHC复合物不能稳定存在从而无法有效诱导特异性CTL。同样多肽与HLA-I类分子之间过低的亲和力导致重组HLA-I类分子无法正确折叠，这在很大程度上阻碍了低亲和力抗原肽四聚体的应用[19]。通过本研究建立的超滤-HPLC法有助于优化复性条件，帮助提高pHLA复合物的形成效率，尤其以重链和轻链融合表达的重组HLA-I类分子结合抗原肽的能力大幅提高，更有利于形成pHLA复合物。鉴于pHLA复合物在未来免疫治疗与探针诊断领域的应用前景，本研究所建立的超滤-HPLC法可用于pHLA复合物制备过程的质量控制，在HLA-I类分子与抗原肽相互作用研究、人工APC以及特异性四聚体探针应用开发方面都具有优势。