Western blot 操作流程及结果分析（一）

原理、材料及蛋白样品制备

一、基本原理：

Western blot即蛋白质印迹试验，也叫免疫印迹试验，其基本原理是通过电泳将细胞或组织蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体对某一特定的抗原（即蛋白）进行着色，最后通过分析着色的位置和着色深度获得该蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况。

Western blot广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，它既是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，也是国自然基金研究中使用最多的常规技术之一。

二、材料准备：

1、主要试剂选购建议如下：

蛋白一抗可以选购CST、Santa crus、Abcam或Sigma公司产品；荧光标记二抗建议选用北京中杉金桥公司产品；预染蛋白Marker建议选用Fermentas公司产品；NC膜或PVDF膜可以选用Millipore公司产品；ECL化学发光试剂盒可以自Amersham公司选购；显影液及定影液建议购买Kodak公司产品；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1.5M Tris-HCL（pH8.8）、1.0M Tris-HCL（pH6.8）、30%Acrylamide（丙烯酰胺）、5×loading buffer、5×SDS电泳缓冲液、10×转印缓冲液、10×TBS洗液可以就近选购或自行配置，也可由我公司订购。

2、主要仪器可参考如下：

低温高速台式离心机（Eppendorf 5417R、5415R，德国）、紫外分光光度计（SpectronicGenesys 5，美国）、酶标仪（Thermo Mμltiskan MK3，美国）、SDS-PAG电泳系统（Bio-Rad，美国）、控制型圆周振荡器（IKA KS 130，德国）、旋转混合仪（QB-128，国产）、塑料薄膜封口机（SF-200，国产）。

三、操作步骤：

1、目的蛋白提取：

单层贴壁细胞总蛋白的提取：

（1）、细胞培养结束后，倒掉培养液，并将培养瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，或将瓶直立放置2min使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走。

（2）、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3），平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，即洗涤细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）、按照6孔板每孔加入100-150μl裂解液的比例，每瓶加入预加蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液300μl，冰上裂解细胞3min；为使细胞充分裂解，培养板要在冰上经常来回摇动。加入裂解液体积及裂解时间，应根据细胞数量以及预期蛋白浓度和靶蛋白显影难易确定，一般5×105细胞加入100μl裂解液即可；如果靶蛋白含量较低，显影较为困难时，可适当减少裂解液体积，同时适当增加裂解时间，以提高蛋白浓度。

（4）、裂解完成后，用干净的刮棒将细胞刮至培养瓶的一侧（动作要快），然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至预冷的1.5ml离心管中。整个操作应尽量在冰上进行。

（5）、转移含裂解细胞的离心管至预冷的高速低温离心机，4℃12000rpm离心20min。注意离心机必需提前预冷至4℃备用，一般高速低温离心机由室温预冷至4℃大约需要15~20min钟左右，因此可在实验开始前首先进行离心机的预冷；离心时间可以试离心情况适当延长或再次离心，保证细胞碎片等全部离心至管底，上清中不含碎片或絮状物质，以免影响后续蛋白变性。

（6）、离心结束，转移上清至一新的预冷的1.5ml离心管中，以备测定蛋白浓度。转移上请时，建议左手拇指、食指捏住旧管远离上清的上端（不能捏在上清部分，以免导致蛋白高温降解），使离心管呈45°倾斜，沉淀在管底上部，移液器枪尖沿下部管壁逐渐下移收集上清；以100μl裂解液为例，离心结束大约可以收集上清80~90μl，此时宁可损失少部分蛋白上清，也不能吸入沉淀；此外新管必须提前预冷，并保证一直放置在碎冰中。

悬浮细胞总蛋白提取：

（1）、细胞培养结束后，转移细胞到1.5ml 离心管中收集细胞，一般5-10×105细胞分装一管。细胞较多时可以使用5ml、10ml离心管，具体可依据本单位离心机条件和规格选择。

（2）、细胞放入离心机，6000rpm离心1min沉淀细胞；注意离心时转速不易过高，否则容易导致细胞死亡，进而造成蛋白裂解。

（3）、去除离心管中培养基，4℃预冷的0.9%NaCl或PBS洗涤2~3遍，去除洗液；该步骤尽量将洗液去除干净，以免影响后续细胞裂解。

（4）、轻轻拨动离心管底部，弹散细胞；该步骤应尽可能使细胞从沉淀底部弹起并分散开，以免影响细胞裂解。

（5）、含有细胞的离心管插入碎冰中放置，进行预冷。

（6）、每管加入预加蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液100μl，冰上裂解细胞3min。加入裂解液体积及裂解时间，应试细胞数量以及预期蛋白浓度和靶蛋白显影难易确定，一般5×105细胞加入100μl裂解液即可；如果靶蛋白含量较低，显影较为困难时，可适当减少裂解液体积（同时适当增加裂解时间），以提高蛋白浓度。

（7）、转移含裂解细胞的离心管至预冷的高速低温离心机，4℃12000rpm离心20min。注意离心机必需提前预冷至4℃备用，一般高速低温离心机由室温至4℃大约需要15~20min钟左右，因此可在实验开始前首先进行离心机的预冷；离心时间可以试离心情况适当延长或再次离心，保证细胞碎片等全部离心至管底，上清中不含碎片或絮状物质，以免影响后续蛋白变性。

（8）、离心结束，转移上清至一新的预冷的1.5ml离心管中；以备测定蛋白浓度。转移上请时，建议左手拇指、食指捏住旧管远离上清的上端（不能捏在上清部分，以免导致蛋白高温降解），使离心管呈45°倾斜，沉淀在管底上部，移液器枪尖沿下部管壁逐渐下移收集上清；以100μl裂解液为例，离心结束大约可以收集上清80~90μl，此时宁可损失少部分蛋白上清，也不能吸入沉淀；此外新管必须提前预冷，并保证一直放置在碎冰中。

组织中总蛋白的提取：

（1）、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

（2）、按照每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入预加蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上；几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎，直至充分裂解。加入裂解液体积及裂解时间，应试预期蛋白浓度和靶蛋白显影难易确定；如果靶蛋白含量较低，显影较为困难时，可适当减少裂解液体积（同时适当增加裂解时间），以提高蛋白浓度。

（3）、转移含裂解液的离心管至预冷的高速低温离心机，4℃12000rpm离心20min。注意离心机必需提前预冷至4℃备用，一般高速低温离心机由室温至4℃大约需要15~20min钟左右，因此可在实验开始前首先进行离心机的预冷；离心时间可以试离心情况适当延长或再次离心，保证细胞碎片等全部离心至管底，上清中不含碎片或絮状物质，以免影响后续蛋白变性。

（4）、离心结束，转移上清至一新的预冷的1.5ml离心管中；以备测定蛋白浓度。转移上请时，建议左手拇指、食指捏住旧管远离上清的上端（不能捏在上清部分，以免导致蛋白高温降解），使离心管呈45°倾斜，沉淀在管底上部，移液器枪尖沿下部管壁逐渐下移收集上清；以100μl裂解液为例，离心结束大约可以收集上清80~90μl，此时宁可损失少部分蛋白上清，也不能吸入沉淀；此外新管必须提前预冷，并保证一直放置在碎冰中。

（5）、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入预加蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分。然后同样按照步骤（3）和（4）进行离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

注：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。

2、蛋白浓度测定：

（1）、根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液需现用现配，室温放置不超过24h。

（2）、取10μl标准品母液（5mg/ml）用PBS稀释至100μl，制备终浓度为0.5mg/ml的标准品工作液。对于标准品的稀释建议使用PBS或0.9%NaCl，并保证后续实验所使用标准品补足液及蛋白样品稀释液完全一致，以满足酶标仪检测的一致性。

（3）、准备96孔板，按顺序每孔加入PBS补足液（同标准品稀释液一致）20、19、18、16、12、8、4、0μl至蛋白标准品孔中，总计8孔；取新配置标准品工作液，按0、1、2、4、8、12、16、20μl体积分别加到对应孔中，保证每孔20ul标准品；相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。加样时要求标准品一定要加到PBS补足液中，并反复吸打至少3次，以免造成误差。

（4）、根据待测样品数量，在蛋白样品检测孔加入18μlPBS（用以稀释蛋白样品），取2μl待测样品分别加入上述PBS稀释液中，制备20μl待测蛋白样品。要求待测蛋白样品一定要加到PBS稀释液中，并反复吸打至少3次，以免造成误差。

（5）、标准品孔和待测蛋白孔每孔加入BCA工作液200μl，充分混匀，37℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，可延长孵育时间至1h或在60℃高温孵育30min。

（6）、冷却到室温，用酶标仪测定A562值，并记录数值保存。

（7）、以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，在excel表中作图绘制标准曲线：图表类型选择“xy散点图”，添加趋势线，线性回归，在选项里选择显示公式y=ax+b（y=吸光值，x=蛋白浓度），显示R2，R2应大于0.99为宜。

（8）、根据标准曲线，代入蛋白样品吸光值，通过公式蛋白浓度x=（吸光值y-b）/a计算出待测样品蛋白浓度，乘以样品稀释倍数10（2μl蛋白样品原液稀释至20μl，即稀释10倍）即为样品实际浓度（单位：μg/μl）。以上操作均可以在excel表中根据公式统一计算。

3、蛋白样品制备：

（1）、根据实际测定的蛋白浓度，用RIPA裂解液将各组蛋白稀释至统一浓度。

（2）、每管加入含10%β-巯基乙醇的5×loading buffer，混匀。

（3）、100℃水浴锅盖盖煮沸3-5min，使蛋白变性；煮沸过程中，需开盖、盖盖1次，以免爆盖造成样品挥发影响蛋白浓度。

（4）、变性蛋白样品瞬时低速离心，充分混匀，微量注射器上样。

（5）、剩余蛋白样品-20℃冰箱低温保存；建议一周之内使用，保存时间最好不要超过1个月。下次使用时，建议100℃水浴锅煮沸1-2min完全解冻，瞬时低速离心、充分混匀后使用。

备注：为保证研究质量并节约操作时间，应特别注意以下几点：

����在提取蛋白之前，应首先预冷低温离心机；

����蛋白提取过程中，使用所有试剂及离心管务必提前冰浴或4℃冰箱预冷；

����蛋白样品煮沸变性之前，应尽量在冰上或低温处理，室温处理应尽量加快速度缩短时间，以免蛋白降解影响样品质量。