DNA 聚合酶的选择

市面上有多种 DNA 聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将 DNA 聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的 Taq 聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的 PCR 产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的 Taq 聚合酶已经足够。

另外要注意的一点是，进行 T 载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有 A 末端的，因此你在 T 载体连接之前需要进行加 A 反应。或者直接选用普通的 Taq 聚合酶。

引物

引物特异性会影响到 PCR 反应成功的可能性，好的引物设计对 PCR 成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：

引物长度。通常 PCR 引物长度在 18~22 个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。

解链温度 （Tm）。Tm 值的定义是使得一半双链 DNA 解螺旋成为单链 DNA 的温度。引物的 Tm 值通常要在 52~58 ℃ 之间。

GC 含量。最适合的 GC 含量为 40~60%。

就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如 primer 5 和 Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

PCR 操作流程

PCR 操作流程

PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。

PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。

准备好各种试剂和 PCR 仪，就可以开始 PCR 实验：将各种试剂混合并按照说明书设置 PCR 反应。一般 PCR 循环如下：

起始步骤：这对于热启动 PCR 而言是必须的，将反应混合液加热至 94~98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶。这一步的时间取决于所选用的 DNA 聚合酶。

变性步骤：DNA 本身是双链结构，而 DNA 扩增需要引物与单链 DNA 模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链 DNA。这是 PCR 循环中的第一步。

退火步骤：变性之后，DNA 模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与 DNA 模板互补，当反应温度降至 50~65 ℃ 时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的 Tm 值，通常比引物 Tm 值低 3～5 ℃。这一步通常维持 20～40 秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始 DNA 合成。

延伸步骤：在这一步，DNA 聚合酶开始 DNA 合成，因此这一步的温度选取的是 DNA 聚合酶的最优温度。通常我们选用 72 ℃，但某些 DNA 聚合酶的最适温度是 68 ℃。这一步与体内的 DNA 复制很相似：DNA 聚合酶按照碱基互补规律将 dNTPs 加到引物的 3’ 末端最终得到新的 DNA 双链片段。延伸时间取决于目的 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的合成能力。一般而言 DNA 聚合酶每 60 秒能够合成 1 kb 长度的 DNA。

循环：第 2 步至第 4 步称为一个循环。每次循环之后 DNA 的量均是前一次的两倍。通常一次 PCR 反应进行 30~35 个循环。在前几轮的 PCR 循环过程中 PCR 产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dNTPs 和引物的量的减少以及 DNA 聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此 PCR 反应的产量也受到了限制。

最后的延伸步骤：当 30~35 个循环结束后，我们通常会以 68~74 ℃ 延伸 5~10 分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 DNA 全部反应完毕。

保存温度：通常我们设置 4~10 ℃ 为反应后 PCR 产物的保存温度。

每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。

反应最终的 DNA 扩增量可用 Y=(1+X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现「停滞效应」，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’ 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的。

以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3’ 端开始延伸，其 5’ 端是固定的，3’ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是「长产物片段」。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即「长产物片段」) 结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5’ 端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3’ 端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的「短产物片段」。

不难看出「短产物片段」是按指数倍数增加，而「长产物片段」则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。

二

PCR 常见问题原因及对策

二

PCR 常见问题原因及对策

无扩增条带

酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95 ℃ 加热 5~10 分钟。

引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。

PCR 产物量过少

退火温度不合适。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

PCR 循环数不足。增加反应循环数。

引物量不足。增加体系中引物含量。

延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。

DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。

扩增产物在凝胶呈弥散状

酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。

MgCl2 浓度过高。可适当降低其用量。

模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。

引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。

循环次数过多。增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用两种温度的 PCR 循环。

退火温度过低。

电泳体系有问题：

① 凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

② 凝胶没有凝固好；

③ 琼脂糖质量差。

若为 PCR 试剂盒则可能：

① 由于运输储存不当引起试剂盒失效；

② 试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

扩增产物出现多条带（杂带）

引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

样品处理不当。

Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。

若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。

外源 DNA 污染。确保操作的洁净。

阴性对照出现条带

试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

条带大小与理论不符

污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

模板或引物使用错误。更换引物和模板。

基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。

献给初学者系列

文章来源：英格恩生物

图片来源：英格恩生物

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