使用说明:
1. 细胞株的复苏
a. 将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染),并适当轻轻摇晃促融,切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b. 打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁,注意某些记号笔不耐酒精,小心标注的记号被擦拭掉。
c. 将完全融化的细胞直接离心,或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中,500g离心2-5min,吸除上清,注意不要吸走细胞沉淀,然后用新鲜完全培养液重悬后转移至培养器皿,混匀,置于CO2培养箱37℃培养。
d. 第二天视贴壁或生长状态,更换培养液。
2. 贴壁细胞的常规传代流程
a. 将细胞培养液、PBS等放入37℃水浴锅内预热。
b. 以10cm细胞培养皿为例。吸出原培养皿中的培养液,用2-5ml无菌PBS润洗细胞1-2次以去除残留的血清(如果细胞贴壁较差,润洗时要轻柔以避免细胞飘起),然后加1-2ml胰酶细胞消化液(含EDTA)室温消化,注意消化时间,通常为1-5分钟。如果细胞比较难消化,可以置于37℃细胞培养箱一定时间以加速消化。注意:消化时间过长,会导致传代后细胞出现生长状态不良的情况。
c. 每30秒-1分钟用显微镜观察细胞消化情况,贴壁细胞明显收缩、细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起,并用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液,再加入1-2ml新鲜完全培养液,适当晃动细胞皿以终止胰酶作用,用移液器轻轻吹打贴壁的细胞,获取细胞悬液。吹打时需控制力度,避免产生大量气泡,将细胞悬液分别接种到另外的2~5个细胞培养皿内,加入新鲜培养液,置于CO2培养箱37℃培养,第2天观察细胞贴壁生长情况。
d. 也可以在消化后,加3-5ml完全培养液终止消化,用移液器轻轻吹打细胞悬液,尽量把细胞全部吹落、吹散,然后将全部细胞悬液500g离心2-5min,离心后去上清,再用完全培养液重悬后转移到新的培养皿中,添加适量完全培养液,于CO2培养箱37℃培养。
e. 注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液,待细胞密度达到80-90%时需要传代或者冻存。如果没有及时传代导致细胞过密,传代后细胞容易出现生长状态不良的情况。
3. 悬浮细胞的常规传代流程
a. 将细胞悬液转移到无菌离心管内,500g离心2-5min,弃去上清,加入新鲜的培养液,用吸管小心吹散沉淀,获取细胞悬液,将细胞悬液分别接种到另外的2-5个细胞瓶内,加入新鲜完全培养液,置于CO2培养箱37℃培养。
b. 也可以取少量悬浮细胞直接转移到新的培养瓶中,添加适当的新鲜完全培养液,置于CO2培养箱37℃培养。
c. 注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液,待细胞密度达到80-90%时可以考虑传代或者冻存。
4. 半贴壁半悬浮细胞的培养
a. 若悬浮细胞较多且折光率良好,可离心收集,继续培养。
b. 若仅有少量细胞悬浮,也可不用收集,传代操作按常规贴壁细胞操作流程处理。
c. 若悬浮细胞较多,离心收集,原瓶中贴壁细胞按照常规贴壁细胞操作流程进行消化、终止消化、吹打,并与之前收集的悬浮细胞混合,接种到新的细胞培养皿中。
5. 细胞株的冻存
a. 按照细胞传代方法收集细胞。
b. 细胞计数:一般要求冻存的细胞,每毫升的细胞数量为1×106-107个细胞。
c. 取适当细胞悬液,500g离心2-5min,弃上清,加入细胞冻存液,重悬,转移到冻存管中,用记号笔标记好细胞株名称、冻存日期、代数等信息,并记录在相应表格中以便管理和快速查找细胞位置。
d. 将冻存管放入专用的细胞冻存盒中,-80℃过夜,然后转移至液氮灌中保存。如果没有专用的细胞冻存盒,可以按下面程序进行冻存:4℃ 1h,-20℃ 2h,-80℃过夜,然后转移至液氮灌中保存。冻存细胞储存在-80℃中通常不建议超过半年,时间太长会影响复苏效率。推荐使用碧云天的BeyoCool™细胞冻存盒(FCFC012)。
e. 为保持细胞的良好状态,每隔1年,取出1-2支冻存的细胞复苏一次,并冻存新的细胞。
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100个/盒
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96个/盒, 50盒/箱
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BeyoGold™无菌盒装吸头(1-200μl, 黄色)
96个/盒, 50盒/箱
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100g
ST476
PBS (10X)
500ml
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BeyoPure™ Ultrapure Water (细胞培养级)
100ml
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BeyoPure™ Ultrapure Water (细胞培养级)
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