1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种肺炎衣原体的高效培养方法及其天然抗原的制备方法与应用。

背景技术：

2.肺炎衣原体(c.pneumoniae，简称cpn)是一种专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，只有在细胞中才能生长，主要通过呼吸道传播，是引起社区获得性肺炎、支气管炎及咽炎等人类呼吸道疾病的重要病原菌之一。肺炎衣原体具有胞外感染性颗粒(又称原体，eb)和胞内复制形式(又称网状体，rb)的双相生命周期，与沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体等相似。3.肺炎衣原体检测主要有病原学检测方法和血清学检测方法；病原学检测方法分为两种：肺炎衣原体培养和肺炎衣原体核酸检测，其中肺炎衣原体培养是金标准，但肺炎衣原体需要在呼吸道来源的细胞系中集中培养，操作较繁琐；核酸检测主要是通过特异性的探针和引物扩增目的基因，但临床样本易污染，操作要求高，不易推广；血清学检测方法主要是利用重组抗原检测血清中特异性肺炎衣原体抗体，如elisa等。4.目前，由于肺炎衣原体较难培养，目前也无完善的培养方法，其培养方法一般是基于沙眼衣原体的培养方法，在细胞系、培养条件及干预措施等方面加以改进而获得。此前有研究表明，在肺炎衣原体培养过程中，添加合适的抗菌素可抑制宿主细胞代谢，从而为cpn的生长繁殖提供更多的养分；cpn感染样品经多次离心可明显提高培养的有效性；单层细胞用右旋deae或poly-l-lysine处理后亦可提高培养的敏感性，但侵染效果均不明显。5.由于肺炎衣原体培养难度大，建立合适的体外培养方法尤为重要，且近年来社区获得性肺炎频发，尤其是儿童，在临床检测中急需一种特异性强、灵敏度高的肺炎衣原体原料。目前，现有的肺炎衣原体培养方法存在各种各样的问题，如培养过程复杂、费时，感染率低，扩大培养困难，这些都极大地限制了肺炎衣原体的检测技术和相关药物的快速发展。因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明针对肺炎衣原体的特点，提供了一种肺炎衣原体的高效培养方法，制备的肺炎衣原体的产量高、感染率高，该方法操作简单，易于扩大培养；在此技术上，本发明还进一步提供对应的肺炎衣原体天然抗原的制备方法及其应用。7.为解决上述问题，通过开展高产量肺炎衣原体培养方法的大量研究，得到改进的培养方案：通过采用物理(摇床慢摇)与化学(peg处理)相结合的方式来提高肺炎衣原体的产量；同时，通过超高速离心的方法获得高纯度天然肺炎衣原体抗原，应用于肺炎衣原体肺炎的临床检验中。8.本发明提供的技术方案如下：9.第一方面，本发明提供一种肺炎衣原体的高效培养方法，其包括以下步骤：10.s1、肺炎衣原体释放：将肺炎衣原体从原宿主细胞中进行裂解释放。11.优选地，s1步骤的肺炎衣原体释放的方法具体为：将肺炎衣原体在液氮和37℃水浴条件下反复冻融至少三次，再加入适量玻璃珠，涡旋振荡5-10min，以期充分释放肺炎衣原体。该反复冻融至少三次的处理方法的作用是破坏宿主细胞的细胞膜，促进胞内肺炎衣原体的充分释放，并且对肺炎衣原体的活性无影响。12.s2、peg预处理宿主细胞：在培养好的宿主细胞中加入5-10％聚乙二醇，预处理1h。条件优选为：35℃，5％co2。通过peg预处理，，改变宿主细胞的细胞膜的通透性，便于后续侵染步骤中肺炎衣原体(cpn)侵入宿主细胞，提高侵染效果。13.优选地，聚乙二醇选用peg1500；其他实施例中，还采用其他分子量的peg(如peg3350、peg4500、peg8000)预处理细胞。14.但是实验结果显示，分别将peg1500、peg3350、peg4500、peg8000对宿主细胞(实验采用人喉表皮样癌细胞)进行同样的预处理后，培养3d-7d，镜检观察得到：peg3350组、peg4500组和peg8000组这三组的细胞脱落情况、cpn数以及感染率均低于peg1500组。该方法采用peg1500处理的宿主细胞可提高细胞膜的通透性，并且分子量小的peg对细胞的伤害较小。15.s3、肺炎衣原体侵染宿主细胞：将肺炎衣原体按照接种至宿主细胞中，35℃，5％ co2孵育10min；35℃，5％ co2，60-80r/min，摇床慢摇0.5～1.5h，促使cpn与单层宿主细胞接触，并确保cpn侵染范围更广。16.区别于现有常规的通过离心促进肺炎衣原体与宿主细胞的侵染方法，本技术采用摇床慢摇的方法可最大程度地将肺炎衣原体“散播”在宿主细胞之间，促进肺炎衣原体与宿主细胞的接触，利于肺炎衣原体的充分侵染。并且该慢摇的方法更容易操作，并且对实验仪器的要求更低，操作简单，更利于大批量生产。17.通过前述的peg预处理宿主细胞与此步骤的摇床慢摇辅助感染相结合的方式可显著提高侵染率，大幅度地提高肺炎衣原体的产量。18.优选地，此步骤接种时，肺炎衣原体ar-39菌种需达到105ifu/ml，按宿主细胞：菌种按照体积比(1:50)～(1:100)进行接种。19.s4、肺炎衣原体的培养：将上一步的混合培养液静置培养1～3h后，将培养基更换为含放线菌酮的肺炎衣原体生长液，培养3d-7d。20.优选地，肺炎衣原体生长液以dmem培养基作为溶剂进行配置，其还包括以下成分：胎牛血清(1～10％)、放线菌酮(1～10ug/ml)。这种优选的生长液可降低宿主细胞代谢，为肺炎衣原体生长提供更多营养物质，有利于提高其产量。21.进一步的，所述肺炎衣原体生长液中还添加有抗生素；可选地，所述肺炎衣原体生长液还包括：庆大霉素(10ug/ml)、万古霉素(25ug/ml)。其他实施例中，抗生物可替换成其他种类的抗生物或者其浓度进行调整。22.优选地，所述肺炎衣原体生长液中，胎牛血清的浓度为2％，放线菌酮的浓度为2ug/ml。通过实验证明，在此条件下培养的肺炎衣原体的感染率较高且产量更高，更利于肺炎衣原体的繁殖。23.s5、肺炎衣原体的收集：无菌条件下，将细胞刮下(优选用刮刀)，吹打混匀后，收集细胞悬液，得到肺炎衣原体中间品，进行低温储存。24.经过上述培养3d-7d后，通过瑞式-吉姆萨染色制片和显微镜镜检可知，cpn感染率达100％，90-100％细胞脱落，cpn约107-108ifu。25.所述肺炎衣原体中间品为宿主细胞与大量增殖的肺炎衣原体的混合物。可通过裂解细胞的操作充分释放肺炎衣原体，进行进一步的应用。26.优选地，步骤s1～s5中，宿主细胞与肺炎衣原体的培养条件均为35℃，5％co2。27.优选地，所述肺炎衣原体的高效培养方法中，所述宿主细胞为：人喉表皮样癌细胞。28.优选地，宿主细胞的培养方法如下：29.s01、细胞复苏：将保存于液氮中的宿主细胞置于37℃水浴锅中融化；1000rpm，离心10-20min，弃上清，将沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，置于25t细胞瓶中培养；35℃，5％co2的条件下培养2-3天；30.s02、细胞传代：用适量胰蛋白酶消化细胞，待肉眼观察细胞面出现间隙，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，混匀；1000rpm，离心10-20min，沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，铺板并培养，使细胞培养皿的细胞密度达到90％以上。31.第二方面，本发明还进一步提供一种肺炎衣原体天然抗原的制备方法，其包括以下步骤：32.(1)对前述培养方法制备的肺炎衣原体中间品进行灭活处理：向所述肺炎衣原体中间品中添加甲醛溶液，水浴处理20～30h。33.优选地，灭活处理的条件为：向cpn中间品(约108-109ifu)添加终浓度为0.1％甲醛，37℃水浴24h。34.(2)对灭活的肺炎衣原体进行超声破碎。35.优选地，所述肺炎衣原体天然抗原的制备方法中，超声破碎的条件为：功率180-240w，破碎2-3s，暂停3-4s，工作时间为2-5min。36.(3)对上一步骤的液体进行离心处理，离心条件为4℃，5000rpm的条件下，离心20-30min，去除细胞碎片，收集上清液，并将上清液在4℃，30000xg-50000xg条件下离心30min，获得肺炎衣原体粗品。37.(4)向肺炎衣原体粗品中添加等体积的spg缓冲液，经超滤浓缩后，获得天然cpn抗原。38.第三方面，本发明还提供一种前述的制备方法制备得到的肺炎衣原体天然抗原在临床检测试剂盒中的应用。通过这种临床检测试剂盒可广泛用于检测样品是否存在肺炎衣原体抗体，特异性高，检测结果准确可靠。39.本发明具有以下有益效果：40.1、本发明提供了一种肺炎衣原体的高效培养方法，不仅优化肺炎衣原体的生长液，降低宿主细胞代谢，为cpn生长提供更多营养物质；同时创新性的采用peg预处理宿主细胞与摇床慢摇辅助感染相结合的方式提高肺炎衣原体的产量。41.一方面，摇床慢摇可最大程度地将cpn“散播”在细胞之间，促使cpn与细胞充分接触；另一方面，peg可改变细胞膜的通透性，在一定程度上增强吸附感染。两者的有机结合大幅度地提高cpn感染率，从而获得高产量的肺炎衣原体。42.2、该培养方法还缩短了肺炎衣原体的培养时间，降低其培养成本，且操作简单，易于扩大培养。43.3、本发明还提供一种天然肺炎衣原体抗原，其采用超高速离心的方法获得天然肺炎衣原体抗原，制备工艺简单，且抗原纯度高特异性强，灵敏度高，可进一步提高在肺炎衣原体肺炎诊断过程中的临床检测效果。44.4、本发明肺炎衣原体的培养方法和天然抗原制备方法涉及到的设备少，工序简单，成本低，亦不会对环境产生有害物质；整套制备工艺稳定，适合应用于大量生产以及大规模推广。附图说明45.图1为仅采用摇床辅助感染的培养方法得到的细胞镜检图；46.图2为采用本技术的peg预处理细胞和摇床辅助感染的培养方法得到的细胞镜检图；47.图3为在侵染过程采用离心辅助处理培养得到的细胞镜检图；48.图4为胶体金试纸条检测结果说明图。具体实施方式49.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。50.实施例1肺炎衣原体的培养51.1、实验材料：52.宿主细胞：人喉表皮样癌细胞hep-2。53.肺炎衣原体：肺炎衣原体ar-39：atcc 53592。54.2、本实施例提供一种肺炎衣原体的高效培养方法，其包括以下步骤：55.s1、细胞复苏：将保存于液氮中的人喉表皮样癌细胞hep-2置于37℃水浴锅中融化；1000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，置于25t细胞瓶中培养；35℃，5％ co2培养，3天后，细胞长满单层，准备传代。56.s2、细胞传代：用适量胰蛋白酶消化细胞，待肉眼观察细胞面出现间隙，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，混匀；1000rpm，离心10min，沉淀用dmem细胞培养基(含10％胎牛血清)悬浮，并在显微镜下进行镜检计数；按照3.5-4.5×105进行铺板；35℃，5％ co2培养，使细胞培养皿的细胞密度达到90％以上。57.s3、肺炎衣原体的释放：将来源于atcc的肺炎衣原体ar-39在液氮、37℃水浴条件下反复冻融4次，并加入适量玻璃珠，涡旋振荡5min，以期充分释放肺炎衣原体。58.s4、peg预处理hep-2细胞：在每个细胞孔加入200ul 5％ peg1500，35℃，5％co2放置1h，对细胞进行预处理，利用peg改变宿主细胞的细胞膜，便于肺炎衣原体(cpn)侵入宿主细胞中。59.s5、cpn侵染宿主细胞：将cpn按照200ul/ml接种至hep-2细胞，35℃，5％co2孵育10min；60-80r/min，摇床慢摇1h，促使cpn与单层宿主细胞接触，并确保cpn侵染范围更广。60.s7、35℃，5％ co2静置培养2h后，将培养基更换为含放线菌酮的cpn生长液。61.其中，cpn生长液配制方法为：向dmem培养基中添加1～10％的胎牛血清(fbs)、10ug/ml的庆大霉素、25ug/ml的万古霉素、1～10ug/ml的放线菌酮。62.s8、cpn的观察：35℃，5％co2静置培养72h，瑞式-吉姆萨染色制片，显微镜镜检。63.实施例2肺炎衣原体生长液的优化64.1、实验方法65.按照实施例1的实验方法，设置以下实验组分别进行肺炎衣原体的培养，检测cpn生长液fbs与放线菌酮的添加量对cpn生长的影响，实验设置如下：66.在a组中，分别设置a1、a2、a3、a4和a5五组，每组分别依次向cpn生长液中添加的fbs的体积百分浓度为：0％、1％、2％、5％、10％，其他成分不变；a组的各组的cpn生长液中放线菌酮的浓度为2ug/ml。67.在b组，分别设置b1、b2、b3、b4和b5五组，各组分别依次向cpn生长液中添加的放线菌酮的浓度为：0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml，其他成分不变；b组的各组的cpn生长液中fbs的浓度为2％。68.2、检测方法69.瑞式-吉姆萨染色制片，显微镜镜检，观察记录细胞密度、cpn数、感染率和细胞脱落情况等。70.3、实验结果及分析71.不同实验组培养的产物的检测结果如表1和2所示：72.(1)通过表1中的a1～a5之间的比较可知，添加2％胎牛血清的a3组制备得到的肺炎衣原体的感染率远高于其他组，其产量也最高；这说明添加的2％胎牛血清既可为cpn增殖提供营养物质，且又不会使宿主细胞生长过快。73.(2)通过表2中的b1～b5之间的比较可知，添加2ug/ml放线菌酮的b3组的感染率远高于其他组，肺炎衣原体的产量也最高，效果更好；2ug/ml放线菌酮可抑制宿主细胞的生长，同时又不会对cpn产生毒性。2％胎牛血清和2ug/ml放线菌酮这两者的结合对cpn生长液进行优化，有助于提高cpn的高感染率。74.表1添加不同浓度fbs(a组)[0075][0076]表2添加不同浓度放线菌酮(b组)[0077][0078][0079]实施例3侵染方式的优化[0080]1、组别设置：本实施例为了比较传统的离心处理、摇床慢摇以及摇床慢摇结合peg预处理细胞这三种侵染方式对肺炎衣原体培养效果的影响，设置了c、d和e组这3个实验组，三个实验组的差异仅在于侵染过程的处理方法的差异，如下：[0081]c组：在cpn传代过程中，增加摇床辅助处理；[0082]d组在cpn传代之前，对宿主细胞用5％ peg1500预处理1h，并增加摇床辅助处理；[0083]e组在cpn传代过程中，增加离心辅助处理。[0084]2、实验方法：[0085]上述3个实验组的实验方法分别依次如下：[0086](1)c组：在cpn传代过程中，增加摇床辅助处理；[0087]s1细胞复苏：将保存于液氮中的人喉表皮样癌细胞hep-2置于37℃水浴锅中融化；1000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，置于25t细胞瓶中培养；35℃，5％ co2培养，3天后，细胞长满单层，准备传代；[0088]s2细胞传代：用适量胰蛋白酶消化细胞，待肉眼观察细胞面出现间隙，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，混匀；1000rpm，离心10min，沉淀用dmem细胞培养基(含10％胎牛血清)悬浮，并在显微镜下进行镜检计数；按照3.5-4.5*105进行铺板；35℃，5％ co2培养，使细胞培养皿的细胞密度达到90％以上。[0089]s3肺炎衣原体释放：将来源于atcc的肺炎衣原体ar-39在液氮、37℃水浴条件下反复冻融4次，并加入适量玻璃珠，涡旋振荡5min，以期充分释放肺炎衣原体；[0090]s4 cpn侵染宿主细胞：将cpn按照200ul/ml接种至hep-2细胞，35℃，5％co2孵育10min；将细胞六孔板置于摇床上，室温下慢速摇1h；[0091]s5 cpn生长液(1l)配制：胎牛血清(2％)、庆大霉素(10ug/ml)、万古霉素(25ug/ml)、放线菌酮(2ug/ml)、dmem；[0092]s6 cpn培养：于35℃，5％ co2条件下正常静置培养2h后，将培养基更换为含放线菌酮的cpn生长液；[0093]s7 cpn观察：35℃，5％co2培养72h，瑞式-吉姆萨染色制片，显微镜镜检。[0094](2)d组在cpn传代之前，对宿主细胞用5％ peg1500预处理1h，并增加摇床辅助处理；[0095]s1细胞复苏：将保存于液氮中的人喉表皮样癌细胞hep-2置于37℃水浴锅中融化；1000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，置于25t细胞瓶中培养；35℃，5％ co2培养，3天后，细胞长满单层，准备传代；[0096]s2细胞传代：用适量胰蛋白酶消化细胞，待肉眼观察细胞面出现间隙，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，混匀；1000rpm，离心10min，沉淀用dmem细胞培养基(含10％胎牛血清)悬浮，并在显微镜下进行镜检计数；按照3.5-4.5*105进行铺板；35℃，5％ co2培养，使每个细胞孔的细胞密度达到90％以上。[0097]s3肺炎衣原体释放：将来源于atcc的肺炎衣原体ar-39在液氮、37℃水浴条件下反复冻融4次，并加入适量玻璃珠，涡旋振荡5min，以期充分释放肺炎衣原体；[0098]s4 peg预处理hep-2细胞：在每个细胞孔加入200ul 5％ peg1500，35℃，5％co2放置1h，对细胞进行预处理，利用peg改变宿主细胞的细胞膜，便于肺炎衣原体(cpn)侵入宿主细胞中；[0099]s5 cpn侵染宿主细胞：将cpn按照200ul/ml接种至hep-2细胞，35℃，5％co2孵育10min；将细胞六孔板置于摇床上，室温下慢速摇1h；[0100]s6 cpn生长液(1l)配制：胎牛血清(2％)、庆大霉素(10ug/ml)、万古霉素(25ug/ml)、放线菌酮(2ug/ml)、dmem；[0101]s7 cpn培养：35℃，5％ co2培养2h后，将培养基更换为含放线菌酮的cpn生长液；[0102]s8 cpn观察：35℃，5％co2培养72h，瑞式-吉姆萨染色制片，显微镜镜检。[0103](3)e组在cpn传代过程中，增加离心辅助处理；[0104]s1细胞复苏：将保存于液氮中的人喉表皮样癌细胞hep-2置于37℃水浴锅中融化；1000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基悬浮，置于25t细胞瓶中培养；35℃，5％ co2培养，3天后，细胞长满单层，准备传代；[0105]s2细胞传代：用适量胰蛋白酶消化细胞，待肉眼观察细胞面出现间隙，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，混匀；1000rpm，离心10min，沉淀用dmem细胞培养基(含10％胎牛血清)悬浮，并在显微镜下进行镜检计数；按照3.5-4.5*105进行铺板；35℃，5％ co2培养，使每个细胞孔的细胞密度达到90％以上。[0106]s3肺炎衣原体释放：将来源于atcc的肺炎衣原体ar-39在液氮、37℃水浴条件下反复冻融4次，并加入适量玻璃珠，涡旋振荡5min，以期充分释放肺炎衣原体；[0107]s4 cpn侵染宿主细胞：将cpn按照200ul/ml接种至hep-2细胞，35℃，5％co2孵育10min；1000xg，离心1h，促使cpn与单层宿主细胞接触，并借助离心力将cpn压入细胞内；[0108]s5 cpn生长液(1l)配制：胎牛血清(2％)、庆大霉素(10ug/ml)、万古霉素(25ug/ml)、放线菌酮(2ug/ml)、dmem；[0109]s6 cpn培养：35℃，5％ co2培养2h后，将培养基更换为含放线菌酮的cpn生长液；[0110]s7 cpn观察：35℃，5％co2培养72h，瑞式-吉姆萨染色制片，显微镜镜检。[0111]3、检测方法：参照实施例1。[0112]4、实验结果及分析[0113]从表3的结果可知，采用peg预处理细胞-摇床辅助感染的d组的感染率最高，达到100％，细胞密度最低，其肺炎衣原体的产量远高于另外两组。[0114]上述实验结果证明，采用本发明的改进的肺炎衣原体的培养工艺，利用peg预处理宿主细胞与摇床辅助感染相结合的侵染方式，能够提高肺炎衣原体的感染率，缩短培养时间，极大提高了肺炎衣原体的产量；而且操作简单，易于扩大培养，降低培养成本。[0115]表3不同cpn传代方式比较(c-e组)[0116][0117]实施例4肺炎衣原体天然抗原的制备[0118]1、实验方法：[0119]采用实施例2中b3组的肺炎衣原体培养的方法获得100ml的cpn中间品，按照以下步骤制备天然抗原，并将天然抗原用于临床检测中：[0120]a1、cpn中间品灭活：向100ml的cpn中间品(约108-109ifu)添加终浓度为0.1％甲醛，37℃水浴24h，对病毒进行灭活；[0121]a2、对灭活的肺炎衣原体进行超声破碎，超声条件：功率180-240w，破碎2-3s，暂停3-4s，工作时间为2-5min；[0122]a3、5000rpm，离心20-30min，4℃，去掉细胞碎片；上清经30000×g-50000×g离心30min，4℃，获得cpn粗品；[0123]a4、cpn粗品添加等体积spg缓冲液，经超滤浓缩后，，获得天然cpn抗原。[0124]2、抗原性检测结果[0125]对cpn免疫血清(购自山东硕景生物科技有限公司)进行梯度稀释，以市面上已销售的cpn抗原(购自迈迪安生物科技有限公司)为对照，通过elisa间接法检测本发明制备的cpn天然抗原的效价，检测od450值。具体实验结果见表4：[0126]表4抗原性检测结果[0127]cpn血清稀释倍数自产对照1/1k1.5560.6691/1w0.2560.129[0128]实验结果显示本发明制备的cpn天然抗原在1/1k和1/1w两个实验条件下，效价均远高于外购cpn。[0129]实施例5肺炎衣原体天然抗原在胶体金法肺炎衣原体igg检测试剂盒的应用1、cpn天然抗原的应用[0130](1)将本发明中制备的cpn天然抗原用包被液(20mm pbs 5％蔗糖ph7.4)稀释至工作浓度作为检测线(t线)包被原料，与质控线(c线)包被原料(羊抗鼠igg，购自山东硕景生物科技有限公司)使用划膜仪在nc膜上划线，后37℃烘30min，完成原料固相化。[0131](2)将已固相化的nc膜与肺炎衣原体igg检测试剂盒用样品垫、金标垫(金标记鼠抗人igg)、pvc底板、吸水纸、mark贴进行组装，用切条机切成3～4mm的试纸条待用。[0132]本发明所涉及到的样品垫、金标垫、nc膜、pvc底板、吸水纸、mark贴均购自山东康华生物医疗科技股份有限公司。[0133]2、性能检测[0134]本实验采用对比试纸条和本技术制备的试纸条分别检测72例血清样本，分析原料敏感度、特异性、符合率。[0135](1)检测方法：[0136]对比试纸条：肺炎衣原体igg抗体检测试剂盒(胶体金法)，购自山东康华生物，注册证号：国械注准20153401655。使用前，将试纸条和样本恢复至室温使用。[0137]将对比试纸条和本技术制备的试纸条分别平放在桌面上，按照以下方法分别对样品进行检测：加入15ul待测血清样本，添加50-70ul样本稀释液，20min左右观察实验结果。只有t线显色检测结果为阴性，t线和c线显色表明结果为阳性，都不显色说明试纸条无效，检测结果无效。胶体金试纸条检测结果说明见图4。[0138](2)检测结果及分析[0139]对72例血清样本的检测结果见表:5和表6，从表中的结果可知：[0140]①本发明中制备的肺炎衣原体天然抗原制备的肺炎衣原体igg检测试剂盒(试纸条)与对照试剂盒(试纸条)对比得到，阳性显色均可拉开差距，敏感性符合要求，检出率较对照高，特异性更好；[0141]②与对照比较统计符合率结果，其阳性符合率100％，阴性符合率98.1％，总符合率98.6％。这说明本发明的肺炎衣原体天然抗原作为诊断原料应用到肺炎衣原体诊断试剂中具有良好的特异性、敏感性及符合率。[0142]表5样本检测结果[0143][0144][0145]表6符合率[0146][0147]备注：表5、表6中阳性区间列数值表示阳性显色强度，数值越大显色越强，t≥1为阳性，t＜1为阴性。[0148]可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。