阅读量：

96

作者：

栾雅梦

展开

摘要：

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是最大的植物RNA病毒属—马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表种,其基因组编码两个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),在自身蛋白酶的作用下切割成11个成熟蛋白,其中,辅助成分蛋白酶(Helper component proteinase,HCpro)参与病毒的复制,RNA沉默抑制,蚜虫传毒和症状形成等重要生命过程.圆柱状内含体蛋白(Cytoplasmic inclusion protein,CI)在病毒侵染的细胞中形成的风轮状内含体是马铃薯Y病毒科Potyviridae病毒鉴定的重要特征,同时参与病毒复制,细胞间移动和症状形成等过程.HCpro与CI参与症状形成过程,但具体机制还不清楚.研究表明HCpro的三维结构与抗性基因的识别密切相关,暗示HCpro三维结构在病毒症状形成过程中具有重要作用.对CI编码的氨基酸序列分析发现PVY CI的C端存在真核生物翻译起始因子eIF4E的潜在结合基序:YxxxxLΦ基序.为研究HCpro和CI在症状形成过程中的作用,本研究在PVYN605侵染性克隆基础上,分别将HCpro不同位置插入标签序列,分析HCpro三维结构与症状之间的关系,通过定点突变技术突变YxxxxLΦ基序中保守位点鉴定该基序在病毒症状形成过程中作用.具体结果如下: (1)HCpro结构变化影响PVY症状形成.N端与中心区域对PVY的症状形成的影响更大.在PVYN605侵染性克隆基础上,将标签序列IDAGGS分别插入HCpro的N端区域,中心区域和C端区域氨基酸S1S2,I252V253和L313V314,获得PVY-HCS1-S2,PVY-HCI252-V253,PVY-HCL313-V314突变体.通过农杆菌浸润的方法将野生型及其突变体病毒接种本氏烟.结果显示,所有的突变体均能够系统侵染本氏烟.接种4天后PVY-HCS1-S2突变体能够移动到系统叶片;接种后25天,与PVY野生型病毒相比,接种PVY-HCS1-S2突变体引起寄主系统叶片严重皱缩,植株明显矮化.接种4天后,未能在本氏烟系统叶片检测到PVY-HCI252-V253突变体,但接种后25天可在系统叶片观察到绿色荧光.接种突变体PVY-HCL313-V31425天后本氏烟的症状与野生型相比无显著差异. (2)在HCpro不同区域插入标签序列影响HCpro抑制沉默能力.将标签序列IDAGGS分别插入瞬时表达载体pCa-35S:HCpro的N端区域,中心区域和C端区域氨基酸S1S2,I252V253和L313V314,获得野生型HCpro及突变体HCproS1-S2,HCproI252-V253,HCproL313-V314的瞬时表达载体.抑制RNA沉默试验结果显示,与野生型相比,突变体HCproS1-S2抑制RNA沉默能力增强,突变体HCproI252-V253抑制RNA沉默能力显著减弱,突变体HCproL313-V314的抑制RNA沉默能力与野生型相比无明显差异,表明HCpro不同区域的特定结构或序列在抑制RNA沉默过程中具有重要作用. (3)突变CI中YxxxxLΦ基序影响PVY的症状形成.将PVY CI中潜在的eIF4E识别基序YxxxxLΦ基序中保守位点Y,L突变为A,获得PVY-CIY513AL518A突变体.通过农杆菌浸润方法分别接种本氏烟,普通烟,结果显示,与野生型相比,PVY-CIY513AL518A突变体病毒RNA和蛋白积累水平降低,病毒扩散能力减弱. (4)未发现CI中YxxxxLΦ基序与eIF4E互作的充分证据.已有研究表明YxxxxLΦ基序普遍存在于eIF4E互作蛋白中.构建含野生型PVY-CI与及突变体CIY513AL518A全长编码序列,和CI及突变体CIY513AL518A C端的酵母表达载体,结果未发现CI通过YxxxxLΦ基序与eIF4E,eIF(iso)4E互作证据.构建CI及突变体CIY513AL518A,eIF4E,eIF(iso)4E的BiFC载体,结果发现CI及突变体CIY513AL518A均与eIF4E体内存在互作.

展开

关键词：

辅助成分 蛋白酶 柱状内含体 马铃薯 病毒病 症状 形成过程

学位级别：

硕士

学位年度：

2019