（1）实验方法描述：

本虚拟仿真实验包括蛋白质酶解并用纳米材料富集磷酸化肽后用LC-MS技术分析鉴定磷酸化蛋白质的过程。选择虚拟实验的模式，学生在网络平台的虚拟环境下完成实验过程并获得实验结果。实验平台为学生提供可以参考的实验条件和步骤。

实验过程包含以下方法：①学生学习过程：实验给定一个简单混合蛋白质体系，经胰蛋白酶酶解后得到混合肽段；用修饰的TiO2的纳米材料富集肽段中的磷酸化肽段；富集后的磷酸化肽段经LC技术分离；用LC-MS/MS联用技术分析鉴定分离获得的磷酸化肽段；根据获得的质谱数据并利用给定数据库解析确定鉴定所得的蛋白质种类以及磷酸化修饰位点。②方法应用研究过程：同上述实验过程，用优化的实验方法对给定复杂生物样品体系进行虚拟实验研究；通过利用开放数据库对实验获得的质谱数据检索，确定一系列磷酸化蛋白质；对鉴定的蛋白质进行文献文献检索和阅读，了解该蛋白质的生物功能。

虚拟实验平台实验过程框图见附件1.

液相色谱串联质谱分析细胞中蛋白质序列实验流程图和部分实验平台图见附件2.

从化学的角度设计的具体实验目的、方法和步骤包括：

1)考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量

该步骤的实验目的：确定样品蛋白质的浓度，以确定后续蛋白质酶解实验应该选择的胰蛋白酶用量。

1-1.吸收曲线的绘制

取两只1.5 mL离心管，根据表1分别加入相应量的标准蛋白溶液、染色液和去离子水，充分混匀。反应一段时间后，用1号溶液作为空白，在450-700 nm波长范围内测定2号溶液的吸收曲线，确定最大吸收波长。

表1吸收曲线溶液的配置

离心管编号

标准蛋白质溶液（μL）

染色液（μL）

去离子水（μL）

1

0

800

200

2

200

800

0

1-2.标准曲线的绘制

取6只1.5 mL离心管，按照表2配制溶液，得浓度分别为0、3、6、12、18、24μg/mL的系列标准溶液。充分混匀，一段时间后，以0号溶液调零，测量1~5号标准溶液在最大吸收波长处的吸光度，记录数据。（注：测量过程需在5~10min内完成）

表2标准曲线溶液的配制

样品编号

0

1

2

3

4

5

染色液(μL)

800

800

800

800

800

800

标准蛋白溶液(μL)

0

10

20

40

60

80

去离子水（μL）

200

190

180

160

140

120

1-3.复杂蛋白质样品中蛋白质含量测定

取2只1.5 mL离心管，分别加入10μL的未知生物样品，按标准曲线的溶液配制方法配制未知样品溶液，在最大吸收波长处测定吸光度。

1-4.蛋白质定量

绘制标准曲线，根据朗伯-比尔定律A=εbc计算蛋白质含量（ug/mL）。

2)蛋白质的胰蛋白酶酶解方法：

该步骤的实验目的：考察酶解条件对酶解产物的影响；将样品蛋白质酶解为肽段，以便后续LC-MS/MS对蛋白质进行分析鉴定。

2-1.混合蛋白溶液的配置和酶解（无需还原烷基化）步骤

分别称取0.5 mg牛beta酪蛋白（β-casein）、2 mg马肌红蛋白（MYO）、2 mg牛血清白蛋白（BSA）于1.5 mL离心管中，加入995 μL 25 mM的碳酸氢铵水溶液（pH=7.9），煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的溶液冷却到室温，按蛋白与胰蛋白酶质量比40:1的量加入胰蛋白酶，于混旋仪中保持37 ℃混旋溶液16小时，即可得混合蛋白的酶解液。

2-2.细胞系样品的胰蛋白酶酶解（还原烷基化）步骤

吸取2 μL细胞裂解样品加入到1.5 mL离心管中，加16 μL 25 mM的碳酸氢铵水溶液（pH=7.9）和2 μL 200 mM的二硫苏糖醇（DTT）水溶液后55 ℃反应1小时（还原蛋白的二硫键），再加入1 μL 500 mM的碘乙酰胺（IAA）水溶液避光反应半小时（以IAA的酰胺基封闭上一步还原反应生成的巯基基团）。将上述溶液用25 mM的碳酸氢铵水溶液（pH=7.9）稀释5倍，按蛋白与胰蛋白酶质量比40:1的量加入胰蛋白酶，置于混旋仪中37 ℃恒温反应16小时。酶解产物真空冷冻冻干后以备富集实验使用。

3)纳米材料富集磷酸化肽段

该步骤的实验目的：富集酶解产物中的磷酸化肽段，以便后续LC-MS/MS对蛋白质进行分析鉴定。

3-1.混合蛋白酶解溶液中磷酸化肽段的分离富集

用上样缓冲液（ACN/H2O/TFA=50/49.9/0.1, v/v/v）配制10 mg·mL-1磁性二氧化钛纳米材料分散液。取1μL混合蛋白的酶解液与10 μL磁性二氧化钛纳米材料分散液和上样缓冲液混合于500μL EP管中，补加上样缓冲液至100 μL。于恒温混旋仪中，37 ℃下振摇30min完成富集磷酸化肽。

富集完成后，用100 μL上样缓冲液分三次洗涤富集了磷酸化肽的材料，再加入10 μL洗脱液（0.4 M氨水）于材料中，在37 ℃下振摇20 min洗脱富集得到的磷酸化肽。将洗脱液冻干以备HPLC-MS分析。（对磁性材料用磁铁分离；非磁性材料用高速离心机分离）。

3-2.细胞系样品酶解产物中磷酸化肽段的分离富集

用上样缓冲液配制10 mg·mL-1磁性二氧化钛纳米材料分散液。加入50 μL磁性二氧化钛纳米材料分散液和50 μL上样缓冲液于冻干的血清酶解样品，混匀后置于恒温混旋仪中于37 ℃振摇30 min完成富集。

对富集后的材料用200 μL上样缓冲液分三次清洗，在清洗后的材料中再加30 μL洗脱液（0.4 M氨水）并在37 ℃下振摇20 min洗脱富集到的磷酸化肽。重复洗脱2次。合并两次的洗脱液，冻干以备HPLC-MS分析。

4)磷酸化多肽HPLC分离分析

该步骤的实验目的：考察色谱流动相分离梯度对分离结果的影响；优化色谱分离条件。

4-1.混合蛋白磷酸化多肽HPLC分离分析

流动相配比为A相：95 %水+5 %乙腈+0.1 %甲酸；B相：95 %乙腈+5 %水+0.1 %甲酸，体积比。

取12 μL A相溶液重溶冻干的洗脱磷酸化多肽，再用nanoLC及在线ESI质谱对重溶液进行分离分析。取10 μL重溶液上样到C18分析柱（75 μm x 25 cm）上，然后进行梯度分离。流动相梯度为t：0-10-90 min，B%：2-2-40。流速为300 nL/min，ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式（DDA）下运行。具有正二、三、四价的肽段离子在下述步骤5）依次通过高能碰撞解离（HCD）继续碎裂。

4-2.细胞系样品蛋白磷酸化多肽LC-MS分析

流动相配比为A相：95 %水+5 %乙腈+0.1 %甲酸；B相：95 %乙腈+5 %水+0.1 %甲酸，体积比。

取12 μL A相重溶冻干的洗脱多肽，再用nanoLC及在线ESI串联质谱对重溶液进行分离分析。实验中使用的色谱为EASY-nLC 1000系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），质谱为Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA）。取10 μL重溶液上样到C18分析柱（75 μm x 25 cm）上，然后进行梯度分离。流动相梯度为t：0-10-90 min，B%：2-2-40。流速为300 nL/min，ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式（DDA）下运行。具有正二、三、四价的肽段离子在下述步骤5）依次通过高能碰撞解离（HCD）继续碎裂。

注：此处HPLC-MS可以是联用技术，也可以将LC和MS技术分别使用。分别使用这两种技术时，可以分别考察LC（如不同流动相梯度和不同分离时间的影响）和MS/MS（正负离子模式、串级能量等）对实验结果的影响。

数据依赖性采集（DDA）模式的工作原理示意图见附件3.

5)磷酸化多肽HPLC-MS分析鉴定

该步骤的实验目的：考察质谱电喷雾电压对肽谱图的影响；考察MS/MS正负离子电离模式、串级能量等对质谱鉴定结果的影响；HPLC-MS/MS分离富集和鉴定磷酸化多肽并最终鉴定磷酸化蛋白质。

5-1.混合蛋白磷酸化多肽HPLC-MS分析鉴定

利用HPLC和电喷雾质谱（ESI-MS）的联用技术对步骤4）LC分离的多肽进行鉴定。质谱条件同步骤4），ESI电压为2.2 kV。Orbitrap Fusion质谱仪在数据依赖采集模式（DDA）下运行。具有正二、三、四价的肽段离子依次通过高能碰撞解离（HCD）继续碎裂。

5-2.细胞系样品蛋白磷酸化多肽LC-MS分析

同5-1.

搜库原理示意图见附件4.

6)对HPLC-MS鉴定蛋白质的数据分析

该步骤的实验目的：学生学习通过简单混合蛋白质的串级质谱数据在不依赖数据库的情况下分析解读鉴定所得的多肽氨基酸排序，并根据虚拟实验平台提供的简单数据库检索确定相关蛋白质；学习使用蛋白质质谱数据库，学习通过复杂生物样品的质谱数据，利用开放的数据库确定所鉴定到的蛋白质。

6-1.标准蛋白质酶解多肽的质谱数据分析

对标准蛋白酶解多肽的质谱数据进行解析，根据MS/MS数据拼接确定多肽的氨基酸序列和磷酸化修饰位点。在此基础上利用给定的数据库确定鉴定所得的蛋白质种类。

6-2.细胞系提取蛋白酶解多肽的质谱数据分析

对生物样品质谱数据，通过数据库对数据进行搜库，以确定样品中所鉴定到的磷酸化多肽和磷酸化蛋白质。学生学习使用科学研究中所用的开放数据库。

7)文献阅读

在学有余力的情况下，学生可对实验相关方法进行文献检索阅读，拓展知识面；实验结束后对实验鉴定的重要磷酸化蛋白质进行文献检索和阅读，了解其生物功能。

（2）学生交互性操作步骤说明：

1-1.学生随机抽取实验样品

在虚拟实验平台系统下构建2-3种蛋白质的混合溶液以及5-6种细胞在实验体系中的蛋白质裂解液作为学生实验样品。同时在该平台提供可供学生使用的上述实验样品的实验结果的蛋白质鉴定数据和数据库信息。

学生进行实验时可以随机抽取一组样品（包括一种混合标准蛋白质样品和一种细胞裂解样品）用于当次实验。按照提供方法在虚拟环境下分模块进行实验。

学生在实验过程中，可以参考虚拟仿真实验平台给出的实验方法和过程逐个对各实验模块自主选择实验条件（即设定变量参数）进行实验。根据在不同参数下获得的实验结果反馈信息，重新改变新的条件，进行交互性操作。在条件优化完成后，获得最佳实验结果，并在此基础上学习相关实验的方法原理、仪器原理、实验条件优化方法和仪器的使用。

1-2.蛋白质酶解实验条件优化

模块一是蛋白质酶解实验。为完成该实验，首先要对选取样品所含蛋白质浓度进行紫外-可见分光光度法定量（该步骤可变参数为：吸收波长的选择、显色时间的选择、狭缝宽度的选择）。按照定量结果，学生设计合适的蛋白质和胰蛋白酶的比例以及合适的酶解时间进行样品蛋白质的酶解实验（该步骤可设定的变量为：酶的用量、酶解温度、酶解反应时间）。酶解反应条件的优劣可以通过HPLC-MS实验的结果评判，并由此获得最佳酶解条件。

1-3.纳米材料富集磷酸化多肽条件优化

模块二是磷酸化多肽富集模块。在该模块，用二氧化钛纳米材料富集上述最佳酶解条件下酶解所得到的混合多肽中的磷酸化多肽、分离磷酸化多肽与非磷酸化多肽、并将富集得到的磷酸化肽洗脱（该步骤可设定的变量为：材料用量、富集时间、富集缓冲液条件、洗脱缓冲液条件），为后续的HPLC-MS实验准备实验对象。磷酸化肽富集结果可以通过HPLC-MS实验的结果评判，并由此获得最佳富集和洗脱条件。

1-4.HPLC分离条件优化

模块三是HPLC分离模块。在该模块，学生将上述富集并洗脱得到的多种磷酸化多肽的混合样品经HPLC分离得到分别单一存在的不同磷酸化多肽（该步骤可设定的变量为：色谱柱选择、色谱流动相洗脱梯度）。色谱条件的选择对混合物的分离程度具有重要作用，而是否能将混合多肽很好地分离，又影响了后续MS以及MS/MS鉴定蛋白质的成功与否。HPLC分离的条件的优劣可以用MS实验的总离子流图的峰分离度及出峰数目评价。

1-5.MS分析鉴定条件优化

模块四是MS分析鉴定模块。在该模块，学生将上述HPLC分离得到的磷酸化多肽通过HPLC-MS联用技术对磷酸化多肽进行质谱分析。根据肽的指纹谱图信号强弱选择一些肽段继续进行MS/MS分析并获得串级谱图（该步骤可设定的变量为：质谱离子化电压、鞘气、分析质量范围、质谱分辨率设定、串级质谱的碎裂能量控制、获取质谱数据的正负离子模式）。由串级谱图可以确定鉴定肽段的氨基酸序列，最终确定蛋白质种类。质谱条件的优劣可以通过MS和MS/MS的谱峰结果判断。

1-6.质谱数据搜库及数据分析

对应简单混合蛋白质样品体系，学生根据质谱数据对鉴定多肽的氨基酸顺序自己排序，并提交结果以供虚拟实验平台评判；对应血清或不同细胞蛋白质样品，学生将质谱数据送入开放数据库中，分析鉴定到的蛋白质。

1-7.鉴定蛋白质的生物功能解读

感兴趣的同学可以进行实验相关方法以及鉴定蛋白质的文献检索和阅读。

。