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作者：

岑一欣

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摘要：

蛋白质定向进化可以有效提高酶催化的各种性能,特别是2018年诺贝尔化学奖授予美国加州理工的阿诺德教授后,更是引起了人们极大的关注。但是,定向进化改造后的蛋白质为什么具有更好的催化性能,突变位点如何影响蛋白质的结构变化,这些问题需要结合晶体学或者计算化学的研究才能得到更清楚的答案。通过解析突变体的晶体结构,人们可以更好地了解突变对蛋白空腔形状、电荷甚至整体构象带来的影响。将定向进化与蛋白晶体结构解析结合到一起,可以更好地认识酶工程改造的分子基础。论文构建了三种CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)表达体系,从表达量、表达周期、纯化工序、定向进化难易程度等方面综合考虑,最终选择了 pETM-11-calb在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞内与pGro7共表达的体系。以此为基础,对CALB醇口袋进行定向进化,以乙酸苏合香酯为底物,筛选得到了与野生型选择性相反的S醇选择性突变体。论文得到了对双手性中心酯的四种构型分别具有高立体选择性的CALB突变体的蛋白晶体,并用X射线衍射的方法得到了母体晶体结构以及与产物类似物的复合物结构。通过计算化学方法探讨了各突变体与优势构型产物的结合能力,并分析了各自在催化空腔中的结合模式,阐明了各突变位点对于特定立体选择性的贡献。论文获取了能够高效催化苯甲酸酯水解的QW10与QW4两种CALB突变体蛋白,并用X射线衍射的方法成功解析了它们的蛋白晶体结构。对结构进行分析,发现底物进入三种酶催化空腔的难易程度与它们的催化活性顺序相符。进一步对将晶体结构与底物结合模式进行MD模拟,证明了各突变位点可以分别从位阻、氢键、疏水相互作用、空腔开口大小等方面帮助底物进入催化口袋,从而提高反应催化活性。对QW4及QW10的催化水解中间态形成过程进行研究,发现了 QW4活性中心具有先质子解离后亲核进攻的分步反应机理,而QW10则是采用质子解离和亲核进攻同时发生的协同机理。论文通过基因工程方法,对CHMO(环己酮单加氧酶)蛋白分别采用表面墒降低突变、截短突变、融合表达等方法改善蛋白结晶性能,从不结晶到有结晶,最终获得了具有衍射能力的蛋白质晶体。由于分辨率过低,未能解析出晶体结构。本论文共获得了 8种工程化改造酶突变体的蛋白晶体结构,其中1种为复合物结构,均已上传PDB数据库。

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关键词：

蛋白质表达 定向进化 X射线晶体学 结构解析 催化机理分析