WB作为分子生物学中最常用的实验，包含了很多技巧与知识，想做出漂亮的WB检测结果不是一件易事。

本文针对WB实验各步骤展开了详细解读，包含实验原理及流程、具体操作、注意事项、WB配套产品推荐等。内容较长，可结合小标题查看。

我们还汇总了59个WB实验常见问题&5个条带问题分析放在了文末，大家可以自行下载。

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一、WB实验简介

WB实验原理

免疫印迹（Immunoblotting）又称为蛋白质印迹（Western Blot，WB），是一种综合性的免疫学检测技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。

这项技术利用待检测蛋白与抗体的特异性结合，测定生物样本中的蛋白水平，已经被广泛应用并得到公认。

目前，WB技术已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WB实验一般分为SDS-PAGE样本制备、凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育及免疫检测等步骤。

二、WB实验常见流程

WB标准流程：样本制备→凝胶上样、电泳→转膜→封闭→抗体孵育→显影

WB实验前准备阶段

实验开始前一定要做的事情，是对所研究的目的蛋白在待测样本中的表达水平、蛋白大小、翻译后修饰等背景信息进行深入的了解，同时也需要设置严格的阴性、阳性对照样本。这将有助于在实验出现异常结果时进行排查分析。

通常我们会参考文献或数据库进行样本的选择，下面列举几个常见数据库：

该蛋白在什么组织中表达？

1）网址：www.biogps.org

通过mRNA表达水平给您参考估计不同样本中目的蛋白的表达水平；样本种属可以选择人、小鼠、大鼠等。还可以链接其他的数据库。

2）网址：www.proteinatlas.org

简称HPA数据库，提供人类蛋白质在组织和细胞的分布，并用免疫组化技术。

该蛋白有没有其他的修饰形式？

1）网址：www.uniprot.org

了解目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等。

2）网址：www.phosphositeplus.org

是蛋白质翻译后修饰权威数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。

还想知道该蛋白的具体信息？该蛋白的实验图？有无该蛋白的抗体？更多相关内容查看往期文章：9个 Western Blot 工具，帮你搞定实验最关键的一步！

三、WB实验流程重点分享

第一步：样本制备

1）样本制备4个步骤

样本制备分为样本获取、蛋白裂解、蛋白定量、蛋白定性等4个关键步骤。

①样本获取：组织或细胞取材；

②蛋白裂解：从组织或者细胞中释放获取蛋；

③蛋白定量：获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据；

④蛋白变性：使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合。

处理细胞--抑制剂与激动剂▼

靶标蛋白可能需要进行刺激才会表达，这时候就需要找到合适的细胞处理条件，可以从以下三个渠道找到合适的细胞处理条件。

🚩 参考文献

🚩 产品说明书

🚩 预实验

部分蛋白的处理方法，仅供参考▼

蛋白酶和磷酸酶抑制剂▼

🚩 内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。

🚩 在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解，磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。

蛋白酶和磷酸酶的成分组成（了解一下就行）▼

获得高质量的裂解物▼

根据情况，结合超声、匀浆等物理方法，配合去垢剂裂解。

超声去除裂解样品中DNA干扰，经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。

尽量使用新鲜的样品，新鲜的样品制备提取物背景较低。

细胞组分分离▼

细胞组分分离（cell fractionation ）是指把细胞的各种细胞器或不同组成成分分离的过程，方便快速的分离细胞组份用于下游分析。

不同的亚细胞定位上蛋白的表达不一样，因此在实验前就应该确定目标蛋白的亚细胞定位。

蛋白定量▼

凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。

这也是为了后续在WB曝光的时候作为内参保持一致的前提。

定量方法：紫外吸光光度、铜离子的还原、染料结合

蛋白变性▼

普通的SDS-PAGE上样缓冲液组分：SDS、还原剂、甘油、染料以及Tris-HCl（pH6.8）等。

以下不同组分的作用，其中最重要的是需要了解溴酚蓝的作用为示踪。

膜蛋白注意事项：

跨膜蛋白有二硫键形成和糖基化等翻译后修饰。请尝试如下条件：

🚩 在loading buffer 中加入还原剂，如beta 巯基乙醇，不要煮沸，使用低于70°C的温度，孵育30-60 min。

样品制备建议▼

普通蛋白WB做的得心应手，磷酸化的蛋白却怎么都做不出来？

查看往期文章：磷酸化蛋白WB的6大注意事项，我们整理好了！

2）样本制备之裂解液的选择

第二步：凝胶上样、电泳

1）操作须知

①凝胶制备：

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

它有两种形式：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。

现在很多厂家都会生产不同浓度的预制胶，方便客户使用，客户也节省了不少的时间。预制胶的优势明显，有高分辨率的数据，与主流的电泳槽兼容，上样量大，成本低等。（但是！在用预制胶的时候，切记要撕胶底或侧边的封条，并且拆胶的时候动作轻缓，防止把胶拆坏。在电泳槽中倒入电泳缓冲液，静置一会儿，拔梳齿时注意垂直，保持梳齿的平整。）

②上样与电泳：

a）蛋白预染Marker：采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，为了便于观察电泳效果与转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准。根据待测蛋白的分子量大小，挑选合适的Marker。

b）加入足量的样品：SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30μg总蛋白或100ng纯蛋白；对于组织，我们通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。

c）尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。

d）空置的泳道用等体积的1x Loading Buffer补齐，防止最后的一两个样品条带上扬。

自制凝胶时的注意事项？上样与电泳时还会出现哪些问题？更多相关内容可点击实验盘点 | WB中上样与电泳操作的注意事项查看！

第三步：转膜

1）转膜原理

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。蛋白质从凝胶向膜转移的过程常采用电转印法包括湿转和半干转，与SDS结合的蛋白带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。

2）膜的选择

3）转膜方法

4）转膜必看注意事项

①大分子量蛋白：转膜缓冲液里加入0.1%的SD5；甲醇浓度降到10%甚至更少，用4℃湿转过夜代替半干法转膜；增加转膜时间、电流/电压；

②小分子量蛋白：去净缓冲液里的SDS；保持甲醇浓度在20%；用小孔径的膜；降低转膜时间、电流/电压；

③膜的方向确定: 转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的；

④转膜后背景高: 选择NC膜；

⑤转膜时污染: 避免手指触碰膜，可以用镊子来取膜，油脂和蛋白质会弄脏膜；

⑥滤纸的大小：确保滤纸和膜的大小与胶一致，当使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。

第四步：膜封闭

1）封闭的目的

2）封闭液的选择

通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白（BSA）和脱脂奶粉。

一般来说，脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

脱脂奶粉：性价比较高；通常使用浓度为2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%；某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，选择适当的封闭剂。

第五步：抗体孵育

1）抗体孵育原理

2）抗体如何选择

对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体；为缩小选择范围，我们通常考虑以下几个方面：

①文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。

②反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。

③实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。

④抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

3）抗体孵育、洗涤注意事项

一抗孵育、洗涤：

a.将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；

b.封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4°C过夜。

c.一抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次；

二抗孵育、洗涤：

a.一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释；

b.洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h；

c.二抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次。

抗体稀释小tips：

按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

第六步：ECL显影

1）显影的原理

Western Blot实验的最后一步，是显影。拿到高特异性、低背景的显色图像，这一步至关重要。

显色的原理是实验中的二抗被HRP（辣根过氧化物酶）标记，可采用增强化学发光法（ECL）。ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。

2）具体显影步骤

▲(1) 在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；

(2) 将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;

(3) 用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;

(4) 推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

四、WB实验常见问题汇总

1）59个WB实验常见问题

由于WB实验时间长、细节多，从样品制备到显影，每个步骤中都可能存在问题。这里为大家汇总了实验常见问题：

①为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；

b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

②我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；

b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。

③我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？

尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。

④我的目的带很弱，怎么加强？

最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。

⑤胶片背景很脏，有什么解决方法？

减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。

⑥我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片，是什么原因呢?

a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；

b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。

篇幅有限，更多WB实验问题请至文末领取！

2）5个WB条带常见问题

WB实验过程中常见条带问题分析，有图有真相，也欢迎大家留言讨论！

①无特异性条带原因分析

a）一抗二抗是否使用正确？

种属：一抗是否适用于样本种属；二抗是否匹配一抗；

孵育时间和用量不足；

如没问题，4度过夜，抗体浓度提高2-4倍；

b）蛋白上样量是否足够？

蛋白上样量过低，需要增加上样量；

c）转膜是否充分、完全、过度？

充分：膜与转膜缓冲液浸润以及和胶的充分接触，可用丽春红S检测，避免甲醇浓度过高抑制蛋白转移；

完全：分子量越大时间越长；

过度：小分子量的降低转膜电压或时间；

d）洗膜或封闭过度

降低洗膜次数；

更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间；

更换抗体稀释液，由脱脂奶粉换成BSA；

②高背景（有条带但是背景不正常）

a）一抗或二抗问题

降低抗体浓度和孵育温度；

避免抗体和封闭剂的非特异性结合（磷酸化抗体和牛奶）；

b）封闭不完全

BSA换成5%脱脂奶粉；

提高牛奶浓度；

延长封闭时间；

c）洗涤不充分（非特异性结合没有被完全洗掉）

提高洗涤次数；

提高吐温20浓度；

d）曝光时间过长（条带过黑过粗）

减少曝光时间；

延迟曝光时间；

e）膜的选择（当背景还是很高）

NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低；

f）蛋白降解

加入蛋白酶抑制剂（可以翻倍加）；

制样冰上操作；

用新鲜样本；

g）上样量过多（条带粗1秒曝出）

减少上样量；

③显色不均匀，负片

a）蛋白量过多

降低蛋白上样量；

b）一抗二抗浓度过高

加大抗体稀释度；

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3）正常条带示例

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