氧化还原酶催化的不对称还原反应常被用来制备手性化合物，例如手性醇、羟基酸等，广泛应用于精细化工、制药、食品等领域[1-2]。大多数氧化还原酶催化的不对称还原反应都需要还原型辅酶，而这些辅酶往往价格昂贵，一定程度上限制了氧化还原酶的应用[3]。目前，解决辅酶问题的方法是直接添加辅酶或辅酶原位再生。与直接添加辅酶相比，辅酶原位再生可以大大降低反应的成本，优势明显，是目前解决辅酶问题的主要方法[4]。被用于辅酶原位再生的酶主要有醇脱氢酶[5]、葡萄糖脱氢酶[6]、甲酸脱氢酶[7]、谷氨酸脱氢酶[8]、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[9]等。在前期研究中，我们发现源于毕赤酵母GS115 (Pichia pastoris GS115) 的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP的NADPH再生活力很高 (125 U/mg)，然而其催化的底物6-磷酸葡萄糖价格昂贵，反应的成本也很高[10]。因此，如果将葡萄糖的磷酸化反应与其偶联，有望构建一个NADPH高效再生新方法。己糖激酶是生物糖酵解代谢途径的第一个酶，催化葡萄糖的磷酸化，反应产物为6-磷酸葡萄糖[11-12]。本研究通过己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的共表达，构建以葡萄糖和ATP为底物的NADPH再生体系，如图 1A所示，并对共表达条件进行优化，实现NADPH的高效原位再生。

质粒pCDFDuet-1、重组质粒pET30-GpdPP、毕赤酵母GS115的cDNA (cDNA_GS115) 、毕赤酵母GS115、大肠杆菌BL21(DE3) (Escherichia coli BL21(DE3) )、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、工程菌BL21(pET30-AdhR)均由实验室保存。

限制性内切酶(EcoR I，Xho I)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶溶液(PrimeSTAR® MAX DNA Polymerase)，宝生物(大连)生物工程有限公司(TaKaRa)；AxyPrep质粒DN A小量制备试剂盒、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，杭州Axygen Biotechnology公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、NADP、ATP、抗生素购自北京鼎国生物技术有限责任公司；PCR引物合成和基因测序委托美国Invitrogen公司上海技术服务部；其余试剂和药品均为进口或国产分析纯。

超净工作台，苏净集团安泰公司；振荡培养箱，金坛市富华仪器有限公司；恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；酶标仪，美国Thermo Scientific公司；气相色谱仪，浙江福利分析仪器有限公司；超声细胞破碎仪，宁波新芝科技研究所；高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；凝胶成像仪，上海培清科技有限公司；高速冷冻离心机，美国Sigma-Aldrich公司；电泳仪、PCR仪，美国Bio-Rad公司。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，调pH至7.0，配固体培养基时，再添加琼脂粉至20.0。

大肠杆菌BL21(DE3) 、DH5α培养采用LB培养基，培养温度为37 ℃，振荡转速为200 r/min。大肠杆菌重组子筛选时，根据质粒所带的抗性基因，在LB培养基中添加相应的抗生素(卡那霉素50 mg/L、链霉素50 mg/L)。

PCR引物设计如下：

F_HKpp：5′-CGGAATTCGATGGTTCCTGTTT TGACC-3′；

R_HKpp：5′-CCGCTCGAGTCATTCTGGTGTG AAGAC-3′；

F_HKgs：5′-CGGAATTCGATGCCTATTGCTA AACCAG-3′；

R_HKgs：5′-CCGCTCGAGCTAGGCTTTTTTG TAAGC-3′。

F_HKpp、F_HKgs均带有EcoR I酶切位点，R_HKpp、R_HKgs均带有Xho I酶切位点。

以cDNA_GS115为模板，在50 μL体系中分别进行PCR扩增基因片段HKpp和HKgs。PCR体系：无菌去离子水21 μL，DNA聚合酶溶液25 μL，10 μmol/L上下游引物各1.5 μL，模板1 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃ 1 min。经过电泳，切胶回收目的条带，得目的基因HKpp和HKgs样品。

将获得的目的基因HKpp和HKgs样品和质粒pCDFDuet-1，分别用EcoR I和Xho I双酶切。分别电泳并切胶回收目标条带，再将两个基因酶切产物分别与质粒酶切产物进行连接，连接产物分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR验证重组子，再提质粒送样测序，基因测序确认成功，即得重组质粒pCDFDuet-HKpp和pCDFDuet-HKgs。

感受态细胞的制备参照TaKaRa公司试剂盒说明书。

质粒DNA提取、DNA凝胶回收参照Axygen Biotechnology公司试剂盒说明书。

用重组质粒pCDFDuet-HKpp与重组质粒pET30-GpdPP共转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，挑重组子至LB培养基活化培养。以重组子菌液为模板，用引物F_HKpp/R_HKpp扩增基因HKpp，用引物F_GpdPP/R_GpdPP扩增基因GpdPP，再跑核酸电泳观察扩增情况，两个基因都扩增成功的重组子，可作为工程菌BL21(HKpp+GpdPP)。

用重组质粒pCDFDuet-HKgs与重组质粒pET30-GpdPP共转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，挑重组子至LB培养基活化培养。以重组子菌液为模板，用引物F_HKgs/R_HKgs扩增基因HKgs，用引物F_GpdPP/R_GpdPP扩增基因GpdPP，再进行核酸电泳观察扩增情况，两个基因都扩增成功的重组子，可作为工程菌BL21(HKgs+GpdPP)。

扩增基因GpdPP的PCR引物设计如下：

F_GpdPP：5′-GAAGATCTGATGACCGATACGA AAGCCGTAG-3′；

R_GpdPP：5′-CCCGATATCTTACATCTTGTGCA GCAC-3′。

重组细胞粗酶液制备：工程菌接种于液体LB培养基中(按质粒所含抗性基因添加抗生素，卡那霉素50 mg/L、链霉素50 mg/L)，37 ℃、200 r/min培养至OD600值为0.6。加入0.5 mmol/L IPTG诱导，置于16 ℃、200 r/min培养12 h。

取培养好的菌液若干，4 ℃、8 000 r/min离心5 min收集菌体，弃上清，再用100 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES，pH 7.0) 重悬菌体(细胞干重调至4 g/L)，即得静息细胞悬液。

取静息细胞悬液2 mL，冰浴超声，400 W功率超声破碎20-30次，每次超声持续3 s，间歇7 s，即得粗酶液。

制备1%核酸胶，上样，调节电压至110 V，电泳35 min，电泳结束后，置于凝胶成像仪中观察并拍照。

取粗酶液10 000 r/min离心2 min，上清和沉淀分别加SDS PAGE Loading Buffer，99 ℃热变性 10 min，处理成蛋白样品，备用。电泳时采用5%的浓缩胶和12%的分离胶，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R250染色，再用脱色液脱色。

(1) 诱导温度：控制温度分别为16、23、30 ℃，IPTG诱导时机OD600=0.6，IPTG用量0.6 mmol/L，诱导时间12 h。

(2) 诱导时机：选择最佳诱导温度16 ℃，控制IPTG诱导时机OD600分别为0.6、0.9、1.2、1.5，IPTG用量0.6 mmol/L，诱导时间12 h。

(3) 诱导强度：选择最佳诱导温度16 ℃，最佳诱导时机OD600=1.2，控制IPTG用量分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L，诱导时间12 h。

(4) 诱导时间：选择最佳诱导温度16 ℃，最佳诱导时机OD600=1.2，最佳诱导强度0.6 mmol/L，控制诱导时间为10、12、16、20 h。

在1 mL的石英比色皿中加入100 mmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液600 μL，10 mmol/L NADP和100 mmol/L ATP各100 μL，100 mmol/L葡萄糖100 μL，粗酶液或纯酶液100 μL，340 nm吸光值动态扫描，取2 min内的数据，拟合线性方程，记录下斜率S和R2。Sx106/6 250=NADPH再生速率[单位为μmol/(L·min)]，其中6 250为摩尔消光系数(单位为L/(mol·cm)。

酶的催化活力以每min生成1 μmol产物为 1 U。粗酶液的活力以每L发酵液中所得酶的催化活力计，单位为U/L。纯酶的活力以每g蛋白质的催化活力计，单位为U/g。

分析己糖激酶活力时，将己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶两种粗酶液(或两种纯酶液)按照体积比1:1混合，再测辅酶再生活力(此时己糖激酶为限速酶)，即为己糖激酶活力。

(1) 样品制备：用缓冲液A (20 mmol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑)重悬静息细胞，置于冰水浴中超声破碎，12 000 r/min、4 ℃离心1 min去除细胞碎片，取上清，再用0.22 μL滤膜过滤，所得滤液即为样品。

(2) 平衡镍柱：用缓冲液A冲洗镍离子亲和层析柱，流速1.0 mL/min，待UV280吸光值下降到最低值且稳定后，可上样。

(3) 上样：将制得的样品缓慢上柱，上样量为50 mL，流速为0.2 mL/min，再用缓冲液A冲洗 10个柱体积，至UV280吸光值下降到最低值且稳定。

(4) 洗脱：用缓冲液B (20 mmol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑)洗脱，待UV280吸光值上升时，开始收集洗脱液，并在UV280吸光值下降到较低值时停止收集。

(5) 脱盐：用脱盐柱(HiTrap Desalting，GE Healthcare)对纯化后的纯酶液进行脱盐。用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(100 mmol/L，pH 7.0) 平衡脱盐柱至基线水平，上样(上样量1.5 mL)，上样后采用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(100 mmol/L，pH 7.0) 洗脱，当UV280吸光值开始上升时收集样品，当电导值开始上升时停止收集。

(6) 电泳验证与浓度检测：纯化后的纯酶液用蛋白质SDS-PAGE进行分析，若为单一条带，则表明纯化效果好。浓度测定采用考马斯亮蓝法。以标准蛋白浓度(g/L)为横坐标，吸光值A595为纵坐标，线性拟合，可得一条标准曲线，y=0.498 3x，R2=0.999 (线性范围：0≤x≤1.0 mg/mL)。

以工程菌BL21(pET30-AdhR)诱导表达所得AdhR粗酶液作为催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原的催化剂，以BL21(HKgs+GpdPP)诱导表达所得粗酶液和AdhR同时作为辅酶再生的催化剂，进行多酶协同催化。AdhR酶(醇脱氢酶)[10, 13]催化的反应如图 1B所示。

(1) 反应体系：体系总体积为1 mL，BL21(pET30-AdhR)粗酶液100 μL，BL21(HKgs+GpdPP)粗酶液100 μL，异丙醇50 μL，COBE 10 mmol/L，NADP+ 1 mmol/L，ATP 10 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液 (100 mmol/L，pH 7.0) 补足1 mL。仅用AdhR酶催化时，用100 mmol/L pH 7.0的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液替代BL21(HKgs+GpdPP)粗酶液。

(2) 反应条件：30 ℃、200 r/min。

(3) 分析条件：GC分析；SE54 Capillary Column 60 m×0.54 mm×1 μm；载气N2；柱温120 ℃ 5 min，30 ℃/min，260 ℃ 5 min；检测器280 ℃；进样器280 ℃；进样量1.0 μL。4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)出峰时间5.84 min，(S)4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]出峰时间6.24 min。以100 ppm的正十八烷(n-Octadecane)为内标，(S)-CHBE的定量标准曲线为y=0.665 7x，R2=0.993 8。x为目标化合物浓度(mmol/L)，y为目标锋面积/内标峰面积。(线性范围：0≤x≤30 mmol/L)

经过GenBank数据库检索，得到两条源于毕赤酵母GS115的己糖激酶基因序列：HKpp，HKgs。HKpp基因序列GenBank编号为XM_002490534，基因大小为1 425 bp。HKgs的基因序列GenBank编号为XM_002 490652，基因大小为1 491 bp。

以cDNA_GS115为模板，经过PCR扩增，得到相应的基因条带，如图 2所示。条带大小和理论值一致。

分别将HKpp和HKgs基因构建到pCDFDuet-1的多克隆位点，得到两个重组表达载体：pCDFDuet-HKpp和pCDFDuet-HKgs。再将这两个重组表达载体，分别转化E. coli BL21(DE3) ，即得到两个工程菌：BL21(pCDFDuet-HKpp)和BL21(pCDFDuet-HKgs)。分别对两个工程菌进行IPTG诱导表达，表达结果如图 3和图 4所示，可见均能较好的进行可溶表达。

分别过镍柱纯化，得到HKpp和HKgs的纯酶，条带大小分别接近52 kD和54 kD，与理论值一致。检测比活力，HKpp的比活力为1 274 U/g，HKgs的比活力为1 680 U/g。HKgs的比活力略高于HKpp。

利用重组质粒pCDFDuet-HKpp和pET30-GpdPP共转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，可得共表达工程菌BL21(HKpp+GpdPP)。利用重组质粒pCDFDuet-HKgs和pET30-GpdPP共转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，可得共表达工程菌BL21(HKgs+GpdPP)。

对工程菌BL21(HKpp+GpdPP)进行诱导表达，表达结果如图 5所示，GpdPP的表达量高于HKpp。对工程菌BL21(HKgs+GpdPP)进行诱导表达，表达结果如图 6所示，GpdPP的表达量高于HKgs。 比较图 3、4、5和6可知，HKpp和HKgs单独表达时均可以大量表达，但是双质粒共表达后表达量均显著降低，可能是由于GpdPP的表达较强，占用了细胞内的大量表达资源[14]，从而压制了HKpp和HKgs的表达，也限制了共表达体系的催化活力。

分别将诱导表达后得到的菌液经过处理后，测定NADPH再生催化活力。BL21(HKpp+GpdPP)的活力为150.3 U/L，BL21(HKgs+GpdPP)的活力为310.5 U/L。BL21(HKgs+GpdPP)体系的催化活力是BL21(HKpp+GpdPP)的约2倍。

由于不同酶对表达条件的偏好不同，通过表达条件优化或许能够提高共表达体系的催化活力，因此接下来对BL21(HKgs+GpdPP)体系进行表达条件的优化。

2.3.1 诱导温度对催化活力的影响：对于诱导温度进行优化，分别考察了16、23、30 ℃诱导表达的NADPH再生活力。结果如图 7A所示，16 ℃最佳，诱导温度高对于表达不利，可能是由于高温诱导容易出现蛋白质聚集形成包涵体的缘故[15]。

2.3.2 诱导时机对催化活力的影响：对于诱导时机进行优化，分别在OD600为0.6、0.9、1.2、1.5时加IPTG诱导，再检测NADPH再生活力，结果如图 7B所示，OD600为1.2时诱导表达的催化活力最高。OD600大于1.5时，诱导活力开始下降，可能是由于菌体的生长进入稳定期，有部分菌体细胞开始出现衰退，质粒丢失的情况也增多[16]。OD600小于0.9时，诱导活力较低可能与菌体生物量较低有关。

2.3.3 诱导强度对催化活力的影响：对于诱导强度进行优化，分别考察了4种IPTG用量：0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L，再检测NADPH再生活力，结果如图 7C所示，0.6 mmol/L的IPTG用量最佳。过低的IPTG用量，诱导强度不够，致使诱导活力偏低；而过高的IPTG用量对细胞有一定的毒性，影响细胞的正常生长代谢，也会使诱导活力偏低[16]。

2.3.4 诱导时间对催化活力的影响：对于诱导时间进行优化，分别用IPTG诱导10、12、16、20 h，再检测NADPH再生活力，结果如图 7D所示，诱导16 h最佳。20 h以后，诱导活力开始下降。

经过以上条件优化，BL21(HKgs+GpdPP)共表达体系在诱导温度16 ℃，诱导时机OD600=1.2，IPTG用量0.6 mmol/L条件下，诱导16 h，表达效果最佳。BL21(HKgs+GpdPP)的催化活力比优化前提高了2.7倍，达到856 U/L。文献报道的葡萄糖脱氢酶GdhBS[10]的比活力为1 307 U/g，经检测其在大肠杆菌BL21(DE3) 宿主-pET30a(+)载体中表达的NADPH再生催化活力为736 U/L，与之相比，本研究共表达体系的催化活力略有优势。该催化活力表明，该辅酶再生体系具备了一定的应用价值。

(S)4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是阿托伐他汀的关键中间体，目前主要的制备方法是用醇脱氢酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原得到。前期工作得知[10]，醇脱氢酶AdhR纯酶催化还原COBE制备(S)-CHBE的反应比活力为1 045 U/g，AdhR纯酶氧化异丙醇的反应比活力为485 U/g。AdhR以异丙醇为底物再生NADPH的活力，不能满足其还原COBE的需求。引入新的辅酶再生体系有利于提高反应效率。经检测，BL21(pET30-AdhR)工程菌表达的粗酶液，以异丙醇作为辅酶再生底物时，催化COBE不对称还原的活力为206 U/L。将BL21(pET30-AdhR)工程菌表达的粗酶液和BL21(HKgs+GpdPP)工程菌共表达的粗酶液同时添加到反应体系中，再以异丙醇、葡萄糖、A TP同时作为辅酶再生底物，检测可得，催化COBE不对称还原的活力达到523 U/L，催化活力较原始值提高至2.5倍。两次反应所得产物的GC分析图谱，如图 8所示。由此可见，由HKgs和GpdPP共表达构建的辅酶再生体系具有一定的应用价值。

本研究克隆表达了2个己糖激酶HKgs和HKpp，并分别与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP共表达，构建了2个共表达工程菌BL21(HKgs+GpdPP)与BL21(HKpp+GpdPP)。经过比较，BL21(HKgs+GpdPP)的NADPH再生活力较高。经过进一步对BL21(HKgs+GpdPP )的表达条件优化，在诱导温度为16 ℃，诱导时机OD600为1.2，IPTG用量0.6 mmol/L条件下，诱导16 h，表达效果最佳，NADPH再生活力达到856 U/L。该辅酶再生体系与醇脱氢酶AdhR联合催化，使不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力提高至原始值的2.5倍。本研究构建了一种NADPH高效原位再生新方法。