载体是连接有EGFP的瞬时表达载体,有氨苄抗性。转化到DH5α中,涂含氨苄的平板。倒置培养12个小时候未见菌落,但是17个小时候有菌落,且密度不是很大,单菌落数不多不少的样子。我先是挑单菌落摇菌,准备做菌液pcr,但是37°C转速200培养过夜之后LB培养基仍然是清亮的,没有任何菌生长。再挑单菌落,换了别人配的LB震荡培养,仍然是没有摇起来。最后我挑单菌落加到20μl的水中做菌落pcr,设置了空白对照,pcr结果显示空白对照没有条带,其它菌落pcr只有两个未扩出条带。将pcr条带最亮的几管分别加到4mlLB培养基中,再加入4μl氨苄,37°C振荡培养过夜。最后居然还是没有菌落生长,培养基一片清亮・・・・・・
我在网上查到说,挑单菌落的时候可能挑到平板上未干的连接液,连接液里可能含有未连接到载体上的目的片段,所以pcr可以扩出条带。但是我很确定我挑到了菌落,肉眼看到菌落慢慢的分散开来然后水变浑浊。即使是空载,摇菌应该也能摇起来。平板是刚刚倒的,氨苄的作用肯定存在。氨苄也没问题,别人刚用过我直接拿过来用的,别人的结果没出问题。
以前挑过很多次菌,菌液pcr也做过,,都没有发生这种状况。我觉得我的操作没有问题,但是实在是找不到原因了,哪位高手给指点一下啊……
昨天刚刚又转化了一次,现在已经有14个小时了,肉眼只能看到几个小菌落。一般来说12个小时应该就长得差不多了。转化涂板用的是新配制的氨苄板,菌落生长缓慢会不会是感受态细菌的问题呢?细菌没有接受外源抗性质粒的活性了,但还是能缓慢的在含氨苄的平板上生长,在含有氨苄的LB液体培养基里培养24个小时也不会快速的生长。是不是这样呢? 返回小木虫查看更多
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