含量测定液相色谱法方法验证操作详解含量测定液相色谱法方法验证操作详解 |
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含量测定液相色谱法方法验证操作详解含量测定液相色谱法方法验证操作详解
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原标题：含量测定液相色谱法方法验证操作详解含量测定液相色谱法方法验证操作详解—培优精选|药物分析系列69 进行系列的方法学验证操作之前，先谈一谈分析人员工作中常见忽略的问题——不注重药典的反复学习，更不注重与药典配套出版的药典标准操作规范，前者的重要性不必多说，后者的重要性通常被绝大多数分析人员忽略。
笔者从业十余年，经常碰到一些分析人员犯一些低级的错误，出现问题便不知所措，而这些操作错误却常常在药典标准操作规范中均有描述，因此如果想成为分析方面的高手，更应该把药典及其标准操作规范两本工具书，反复的研读，不同的工作阶段都需要研读，熟能生巧。 在本文中重点介绍含量测定的液相色谱方法学验证操作过程要点，抛砖引玉供同仁们参考，未尽之处请谅解。经典干货，我都不告诉审评员的哦，写的这么明白还不会做，那就真的是无语了啊，祝愿伙伴们工作顺利、开心。 方法学验证操作注解——含量测定液相色谱法方法验证 研究内容 操作过程 一般技术要点说明 方法摸索优化 目标优化梯度条件，确定分析波长。1、 样品溶剂选择；2、 滤膜吸附试验；3、 DAD检测器下，波长选择主成分最大吸收或平台处。4、 分离条件选择；5、 色谱柱对比；（根据情况酌定）6、DAD检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料（制剂研究时需同时进行空白辅料破坏）等成分分离。 1、 一般在无参考标准或标准的方法无法直接套用时,需进行此项研究内容，如3类药。2、样品溶剂：对样品有很好的溶解能力，实验室自然放置稳定存放12小时以上，与流动相有良好的互溶效果。3、续滤液峰面积达稳定最大值，续滤液体积在5ml以下时较为适宜，否则需要重新筛选溶剂。4、破坏程度10%左右（5%—15%）为宜，2mol/l酸或碱90℃水浴12小时无破坏即视为样品稳定，不必再追求降解度。4500lx光照48小时，样品粉末及溶液需要同时做。破坏后的样品溶液及空白溶剂均需调整至流动相pH方可进样，可避免对色谱柱产生不良影响。如果破坏超过20%，需要降低破坏条件。5、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。6、梯度变化要有最高洗脱能力过程，目的证明所有的杂质成分均能够被洗脱检测。7、方法摸索优化实验一般是不上资料的，只是体现在实验记录本中，除非是没有方法依据时，如3类药申报时，梯度选择及波长选择等均需要在资料中体现。8、方法优化完成后，最后在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。9、方法摸索优化实验采用工艺已经确定的实验室小试、实验室放大样品进行，前期用于原料合成样品配合检测时，可以采用大范围的梯度洗脱进行模糊检测分析。 专属性 目的为了验证方法对目标成分检测的区分能力及全面的杂质分析评价。DAD检测器或适宜的通用型检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料，各杂质对照品等在同一天进行分析，可以作为申报资料中杂质谱的论述内容。 1、参照上述过程进行破坏样品制备，空白及阴性样品都要做。2、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。3、梯度要有最高洗脱能力过程。4、以前期确定的分析条件及方法，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。5、本部分数据进资料，最佳采用生产线验证的第1批样品进行。当色谱条件与有关物质检查方法相同时，专属性实验数据可以共用。出图时主成分峰的紫外光谱图及峰纯度图均要出图。 检测限 信噪比法，S/N≥3倍时的浓度为检测限。 先进空白，再进对照品浓溶液（1mg/ml），在主峰相同位置处选择空白溶剂1—2min范围的基线积分得出峰高，按照峰高的3倍计算样品浓度，直接用浓溶液稀释至目标浓度附近即可，资料中体现至少3张图（空白溶剂、浓溶液、及稀释液）。 定量限 信噪比法，S/N≥10倍时的浓度为定量限。 按照基线峰高的10倍计算样品浓度，直接用检测限浓溶液稀释至目标浓度附近即可，连续进样6针，计算峰面积RSD0.999。采用对照品进行。线性范围一定要将回收率试验的最高浓度包含进去，否则回收率浓度超过线性范围，缺乏定量依据，这个错误非常常见。 精密度 同一份供试品（样品）溶液，连续进6次。 计算峰面积RSD |
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