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作者：

梁芳

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摘要：

苹果酸-乳酸酶(Malolatic Enzyme,MLE)是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(Malolactic Fermentation, MLF)过程中的发挥关键作用的酶,可以直接催化L-苹果酸生成L-乳酸.国内外许多科研人员已用基因工程的方法构建了可将苹果酸分解成乳酸的降酸酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),但因为存在苹果酸的运输屏障而导致苹果酸转化效率低.本实验室为解决此问题已构建了表面展示MLE的酿酒酵母,编号为Fm5,但苹果酸的转化效率也不高,分析其酶活低的原因可能是因其不耐酸.本研究首先对MLE酶活低的原因进行探索,对其进行了一般酶学性质研究,研究结论是酸性环境是使其酶活低的原因.相对酿酒酵母而言,大肠杆菌(Escherichia coli)具有生长周期短,转化效率高等优势,本实验室已构建MLE的大肠杆菌高效表达系统.为了提高MLE的耐酸能力,欲通过易错PCR的方法对MLE进行定向进化,构建大肠杆菌突变库,再建立高效筛选的方法,以期从突变库中筛选得到能耐酸的MLE.主要研究结果如下:1.苹果酸.乳酸酶的酶学性质研究本章首先对Fm5进行验证,通过对其形态观察发现,此工程菌株和出发菌株在形态上并无显著差异.从此工程菌中提取质粒pADH1-mle,对其进行PCR验证,得到相应的PCR片段,说明此酿酒酵母工程菌株无误.对MLE的一般酶学性质进行研究,通过高效液相色谱法检测其活性.通过研究,得到MLE的最适NAD+浓度为2mmol/L,最适MnCl2浓度为5 mmol/L,最适pH值为5.7,最适反应温度为30℃,在极酸性条件下MLE的酶活稳定性不好.2.建立高效筛选耐酸苹果酸-乳酸酶的方法本章首先对吩嗪二甲酯硫酸盐-氯化硝基四氮唑蓝(Phenazine Methosulfate Nitrotetrazolium Blue Chloride,PMS-NBT)显色法进行验证,通过在含苹果酸的培养基中,加入异丙基-p-D-硫代吡喃半乳糖(Isopropy-β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG),在28℃条件下,诱导含pET28a(+)-mle的重组大肠杆菌BL213h,产MLE后得到培养液上清,将上清进行PMS-NBT显色反应,将野生型大肠杆菌BL21,含pET28a(+)的重组大肠杆菌BL21,表面展示MLE的酿酒酵母(Fm5),酒类酒球菌的培养液上清作为对照,只有含pET28a(+)-mle的重组大肠杆菌BL21,Fm5和酒类酒球菌的培养液上清使显色液从黄色变成蓝紫色,则说明该方法可用来筛选产乳酸菌株.再将MLE诱导重新表达后,通过pH1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.7处理2h,再进行苹果酸降解反应,得到的上清在96微孔板中进行PMS-NBT显色反应,此为建立的高效筛选耐酸MLE的方法.上清没有使显色液变色的,说明MLE失活,且使MLE失活的临界pH值为3.5.3.耐酸性苹果酸-乳酸酶的定向进化本章通过使用GeneMorph Ⅱ Random随机突变试剂盒,用易错PCR的方法对mle基因进行两轮随机突变,再从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中克隆得到β-葡聚糖酶信号肽基因,并通过融合PCR的方式将该信号肽基因拼接到mle基因上游并插到表达载体pET28a(+)中,成功构建重组表达载体pET28a(+)-mle.再转化大肠杆菌BL21成功构建突变文库,使用MLE的高效筛选方法从突变库中筛选出4株疑似产耐酸性MLE的突变子.并对突变mle基因测序.

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学位级别：

硕士

学位年度：

2013