样本制备是成功进行 HPLC 和 UHPLC 分析的关键。样本制备示例包括：

现有许多已定制的样本制备方法，每种方法都有特殊优势或特定用途。   

HPLC 方法开发

相关资源

制备方法

分析原理

应用

稀释

降低样本中的分析物、溶剂或基质浓度

防止色谱柱/检测器过载，降低样本溶剂洗脱强度

离心

沉淀（基于密度）

去除溶液中的大细胞成分

过滤

去除样本中的颗粒

延长色谱柱使用寿命，防止流体堵塞

蛋白沉淀

通过添加盐、溶剂或改变 pH 值使蛋白减溶

去除溶液中的蛋白

液-液萃取

根据两种可混溶剂中的溶解度差异分离样本组分

根据极性/电荷纯化化合物

固相萃取

使用吸附剂固定相选择性分离/纯化目标分析物

分离生物基质中的小分子，对大生物分子脱盐

免疫亲和捕获

使用抗体选择性纯化分析物

分离生物/环境/食品和饮料基质中的小分子 

蛋白质消化

用蛋白酶将蛋白质切割成肽段

生成多肽，以进行自下而上的蛋白质组学/肽图分析

衍生化

改变分析物物理化学特性的化学反应

提高分析物保留率、稳定性或可检测性

体积排阻

根据尺寸分离样本组分

蛋白缓冲液更换/脱盐，去除大分子

均质化

使用机械力破坏固体样本结构

破坏生物组织、环境样本以改善萃取

QuEChERS

多步骤工艺，包括均质化、液-液萃取、离心、固相萃取

从食品和环境样本中萃取农药

您可以将样本基质视为样本中的任何物质（感兴趣的分析物除外），其中包括从盐到其他化合物和溶剂的所有物质。基质类型可决定样本制备、色谱分析模式和检测方法。了解样本基质是HPLC高效液相色谱分析方法开发中的基本应考量事项。

基质效应是一个广义术语，其描述特定分析物基质改变分析物检测或定量的可能性。这种效应通常以偏差示出，会导致低估或高估溶液现有分析物浓度。

基质效应可能出现在分析中的几乎任何阶段，包括样本制备、色谱柱分离以及检测。以下为几个常见示例：

有几种常用方法可减轻基质效应。应根据分析的具体情况做出正确选择。

如果分析物具足够灵敏度，则较直接的方法是用适当的进样溶剂稀释样本。样本稀释度越高，基质效应越可忽略不计。

其他解决方案包括在分析前萃取，这可消除可能的样本污染来源，从而改善分离效果。使用 2D-LC 或切换为选择性更高的检测方法也可以避免基质效应。

最后，您可在不更改方法的情况下添加标准品。但这样做的话，每份样本的进样次数会增加，因此通常都避免采用这种方法。 

如果是无既定方法可用的情况时，必须仔细规划和执行，以制定稳健程序。在制定 HPLC 或 UHPLC 分析方法时，除了样本制备外，还需要了解四个HPLC高效液相色谱分析方法开发主要流程步骤：

方法搜寻。涉及到筛选各种色谱柱和洗脱液条件。此阶段旨在选择成功进行 HPLC 分离的较佳组合。在实践中，方法搜寻需要大量手动工作来切换色谱柱和流动相以及仪器方法的创建。开始时，可以通过了解目标分析物的特性，将搜寻限定为几种较有前景的候选色谱柱。

方法优化。包括对HPLC方法的各种分离条件进行迭代测试，优化目的在于获得出色的分辨率、速度和重现性。此步骤是HPLC高效液相色谱分析方法开发流程中最耗时的部分，通常需要专业知识才能完善。

稳健性测试。目的在于确定更改分离方法参数造成的影响。优化稳健性对许多HPLC高效液相色谱分析方法开发和验证流程来说都非常重要。 

方法验证。用于确定所开发的HPLC高效液相色谱分析方法是否适合所需应用的行业专用流程。

开发稳健、可重现且可靠的 HPLC 或 UHPLC 方法并非易事，即使对经验丰富的液相色谱工作人员来说也是如此。本视频将向您介绍正确开发 HPLC高效液相色谱方法所需的所有步骤。

对于方法开发，有三个参数发挥作用（重要性依次递增）：化合物保留率 (k)、效率 (N) 和选择性 (a)。 调整选择性的一种常用方法是更改色谱柱化学组成和洗脱液。  如果是手动更改，则此类工作通常很耗时。幸运的是，现代技术使此类流程实现了自动化。

开发稳健、可重现且可靠的HPLC或UHPLC方法并非易事，即使对经验丰富的液相色谱工作人员来说也是如此。 

在某些情况下，通过搜索 Thermo Scientific AppsLab 分析应用库，您可无需方法开发。这个在线库包含一个可搜索的知识库，里面有数千种应用以及详细的方法信息和预填充的 eWorkflow™ 程序。

另一个有助于确定起始方法参数的来源是知名药典中的专论，例如美国药典 (USP) 和欧洲药典 (Ph.Eur.)。

保留行为、色谱柱效率和选择性对两种化合物色谱分离的影响

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开发LC方法仍然是许多实验室的瓶颈，但自动方法开发则可大幅节省时间和资源。有多种硬件和软件工具可用于加快液相色谱分析方法开发流程，提高最终方法质量，并将开发时间从数周甚至数月缩短至数天。

方法搜寻系统设置的流程图

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自动方法开发所需的两个关键硬件功能是：

自动切换溶剂。此技术能在一个序列中切换流动相，而无需手动更换瓶子和吹扫系统。Thermo Scientific Vanquish 方法开发系统包括一个溶剂扩展套件，其中含有一个外部选择阀，用于自动搜寻多达10种溶剂（每个通道）。

自动切换色谱柱。用于早期方法开发，通常包括搜寻多种固定相化学组成。自动切换色谱柱可节省时间和用户精力，不必为了在色谱柱之间手动切换接头而暂停序列。Thermo Scientific Viper 方法搜寻套件包括搜寻四色谱柱化学组成所需的所有流体连接件和毛细管。  

全自动HPLC高效液相色谱分析方法开发流程需要专用软件来引导从方法搜寻到验证的整个过程。部分软件包包括从预测分析物保留行为到生成序列的功能。

例如，ChromSwordAuto Chromeleon Connect 采用人工智能驱动的方法来实现方法优化。ChromSword AutoRobust Chromeleon Connect 使用多变量方法，可简化自动方法稳健性与系统稳定性评估。这两种选件都完全集成到 Chromeleon 中，旨在提供更简便的用户体验。

与 Thermo Scientific HPLC 系统兼容的另一个重要软件包是 S-Matrix® Fusion QbD®，是主要基于质量融入设计的方法来进行方法开发。

开发 HPLC高效液相色谱仪分析方法需要四个不同的流程步骤：方法搜寻、方法优化、稳健性测试和方法验证。

HPLC方法验证是执行调查程序的正式、系统化流程，目的是验证HPLC方法是否适当并且适合既定用途，即：在为该方法描述的限度内提供令人满意且一致的结果。

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