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作者：

苑璟

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摘要：

第一部分 成纤维生长因子21(FGF21)对糖尿病鼠的快速降糖作用目的:已有大量研究表明FGF21对糖代谢有调控作用,连续给药7到14天后可以降低2型糖尿病型高血糖,还能增强胰岛素的敏感性,降低胰岛素抵抗.但很少有研究FGF21的快速降糖的作用.快速降糖对于以高血糖为并发症或者为主要危险因素的疾病例如急性创伤,炎症以及心脑血管疾病等有重要的意义.方法:本实验先用温州医学院提供的人重组FGF21蛋白注射2型糖尿病小鼠(T2D小鼠)14天,用血糖试纸检测小鼠随机血糖.再用Elisa法检测小鼠胰岛素水平.之后,在注射FGF211小时后,用血糖试纸检测小鼠血糖.结果:小鼠随机血糖明显下降并且增强了胰岛素敏感性和降低了胰岛素抵抗.注射FGF211小时后,T2D小鼠血糖和模拟应激性高血糖小鼠血糖都明显下降.提示FGF 21可能也有快速降低血糖的作用.第二部分 血清FGF21水平对脑内FGF21表达水平的影响目的:有研究表明FGF21在患有心血管疾病,肝脏疾病,高血压,肥胖,糖尿病等疾病时血清水平显著增加.可能的机制是机体是对FGF21的信号传导发生了障碍,对FGF21的敏感性减弱,才使FGF21过量表达.非常重要一点是有研究表明FGF21可以穿过血脑屏障(BBB).但同时有研究发现FGF21需要通过细胞上的穿膜蛋白β-Klotho才能与成纤维因子受体(FGFR)结合而激活受体,这使FGF21的作用有组织选择性.而FGF21是否能进入大脑,大脑中是否有β-Klotho的表达和FGF21的受体激活机制还没有研究.方法:本实验用Elisa法检测非高血糖小鼠(ND小鼠)和2型糖尿病高血糖小鼠(T2D) FGF21血清水平.用western blot检测ND小鼠的T2D小鼠的全脑蛋白做中FGF21表达水平.用western blot检测静脉注射外源性FGF21至小鼠后,同的时间点小鼠大脑的不同部位的FGF21,pFGFRl和β-Klotho的表达水平.结果:血清中FGF21在T2D小鼠中明显高于ND小鼠.T2D小鼠大脑蛋白中的FGF21表达显著性高于ND小鼠.静脉注射外源性FGF21至小鼠后不同的时间点收集大脑蛋白,做western blot检测,发现大脑不同部分FGF21的表达的和成纤维成长因子受体1(FGFR1)的磷酸化都发生了变化,并且检测到了β-Klotho的表达.这表明了血清中FGF21的升高对大脑中FGF21的含量和FGFR1受体的激活有影响.但脑中FGF21的含量升高除了外源性FGF21直接进入,是否还存在被诱导升高尚不清楚;FGFR1的磷酸化是FGF21直接激活还是FGF21诱导了其他FGF家族的因子升高而激活的也尚不能定论,但由于检测到了β-Klotho的表达,也有可能可以直接激活受体.这一结果表明FGF21可以穿过血脑屏障进入大脑,也许可以直接作用于中枢神经系统产生作用.第三部分 FGF21对脑内皮细胞的影响目的:神经保护不局限于神经元细胞的保护,对血脑屏障的保护也非常关键.血清中升高的FGF21直接接触到血管内皮细胞,但FGF21对血管内皮细胞是否有保护作用目前以及保护机制没有研究.在血管内皮中FGF21的表达和损伤后的表达变化,传导通路和作用机制,以及受体复合物形式都有待研究.方法:本研究应用Western blot检测FGF21在血管内皮细胞中的表达,缺氧缺糖(OGD)4小时再复氧复糖20小时候后FGF21的表达变化,以及血管内皮细胞被重组FGF21蛋白处理后磷酸化FGFR1和β-Klotho的表达变化,是否对FGF21有时间依赖和剂量依赖.使用RNA干扰(SiRNA)技术,转染FGF21 SiRNA后用Western blot检测分析,以确认血管内皮中FGF21细胞中的表达.转染β-Klotho SiRNA后用Western blot和免疫荧光来观察在β-Klotho基因沉默后,FGFR1能否被FGF21激活以及FGF21/磷酸化FGFRl/p-Klotho在血管内皮细胞上是否共定位.用MTT检测外源性FGF21能否对脑血管内皮细胞在OGD 4小时复糖复氧20小时的损伤产生保护作用.用FITC检测高糖炎症损伤下FGF21对内皮细胞渗透性保护.用western blot检测FGF21通过诱导哪个蛋白升高来进行保护作用.结果:首次发现脑血管内皮细胞中FGF21有表达且能被细胞缺氧缺糖后再灌注损伤诱导表达增加.FGF21在脑血管内皮细胞中能激活FGFR1磷酸化并同时诱导β-Klotho表达增高,且FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho这三者是在细胞是是共定位的.但在β-Klotho基因沉默后FGF21不能激活FGFR1.这一结果说明了在除了脂肪细胞,在脑血管内皮细胞中,FGF21的传导通路也是通过FGF21/FGFR1/βKlotho三聚体复合物的形成,激活FGFR1磷酸化而进行信号传导的.这是首次发现FGF21在非脂肪细胞组织,在脑内皮细胞中也是通过FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚体复合物进行信号传导的,提示这也许是FGF21信号传导的共性.并且外源性FGF21对脑血管内皮细胞的缺氧缺糖后再灌注损伤和高糖合并炎症损伤都有保护作用.FGF21还对内皮细胞在高糖合并炎症损伤下减少其通透性的保护作用,其作用是通过诱导升高PPARγ实现的.FGF21还可以升高细胞膜连接蛋白ZO-1,VE-Cadherin连减少细胞通透性.第四部分: FGF21对神经元细胞的影响目的:之前的实验证实了FGF21能穿过血脑屏障,而神经元作为最重要的神经功能性细胞,FGF21对神经元细胞能否产生保护作用还没有研究.并且FGF21在神经元细胞中有无表达,或能否对FGF21的刺激产生反应,以及FGF21在神经元细胞的受体和信号传导通路是什么.都还有待研究.方法:本研究应用Western blot检测分析小鼠原代培养大脑皮层神经元细胞正常情况下和缺氧后的FGF21表达变化,和小鼠原代培养神经元细胞被重组FGF21蛋白处理后磷酸化纤维生长因子受体1(FGFR1)和β-Klotho的表达变化,是否对FGF21有时间依赖和剂量依赖.用免疫荧光染色检测磷酸化FGFR1和β-Klotho能否被FGF21诱导和是否与FGF21共定位.用C-IP和Western blot检测分析FGF21是否能与FGFR1和β-Klotho形成三聚体复合物.用LDH检测外源性FGF21蛋白能否对小鼠原代培养神经元细胞缺氧或高糖损伤时产生保护作用.结果:小鼠原代培养神经元细胞正常情况下FGF21的表达量极低,但在缺氧损伤后FGF21能被诱导表达增加.在小鼠原代培养神经元细胞中可以看到FGF21/磷酸化FGFR1/β-Klotho是共定位的,且FGFR1被FGF21激活磷酸化.在小鼠原代培养神经元细胞正常状态下,FGF21表达量太低,并不会形成FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚体复合物,FGFR1/β-Klotho也不会形成二聚体复合物.但小鼠原代培养神经元细胞被重组FGF21蛋白处理后,可以观测到FGF21/FGFR1/β—Klotho三聚体复合物的形成.这一结果可以证明在小鼠原代培养神经元细胞中,FGF21的传导通路与脂肪细胞中和之前实验的脑内皮细胞一样,都是通过FGF21/FGFR1/β-Klotho三聚体复合物的形成,激活FGFR1磷酸化而进行信号传导的.并且外源性FGF21对小鼠原代培养神经元细胞在缺氧和高糖的损伤下都有保护作用.

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关键词：

T2D鼠 胰岛素敏感性 快速降糖 血脑屏障 FGF21表达 FGFR1磷酸化 脑内皮细胞 RNA干扰 三聚体复合物 内皮细胞保护

学位级别：

博士

学位年度：

2015

DOI：

10.7666/d.Y2954263