微生物在生物地球化学循环中起着引擎作用，土壤微生物群落对气候变化的响应直接影响着土壤生态系统的结构和功能[1]。微生物的世代周期短、生长速率快，因此微生物群落可能是生态系统中响应气候变化最快的群落[2]。另一方面，微生物的功能和遗传多样性高、进化速率快、扩散能力大，这些特点还可能使其有助于缓解环境变化[3]。因此，研究陆地生态系统微生物群落将如何响应未来全球气候变化有重要的意义。

土壤有机碳是农田土壤肥力的核心，深刻影响着土壤诸多物理、化学和生物学过程，是农作物高产稳产和农业可持续发展的基础[4]。温度与水分是影响土壤有机碳矿化最重要的环境因素，全球气候变化导致的水热条件的变化势必引起土壤有机碳库及其对大气CO2的源汇效应的改变。气候变化与土壤碳库之间的相互作用及耦合机制一直是学术界研究的热点与难点。目前已有的大部分研究从不同层面考察了气候变化对土壤碳库改变的驱动过程及作用机理，包括微生物群落变化[5]、土壤呼吸[6]、有机质分解的敏感性[7]等。Tardy等[8]的研究表明土壤中细菌和真菌的多样性对土壤碳矿化能力有极为重要的影响。跨越欧洲多个国家针对不同土地利用方式下土壤碳循环的研究表明，微生物学指标可以解释高达82%的土壤碳循环的变异程度[9]。在陆地生态系统碳循环的过程中，土壤微生物既通过分解代谢向大气释放碳，同时也通过合成代谢将碳转化成稳定形态储存于土壤中。

对高等动植物的研究表明，物种多样性对气候变化的响应，更受到物种间相互作用关系的影响[10]。通过对全球688份相关研究的meta分析表明，气候变化几乎影响了陆地生态系统所有类型的物种相互作用(如植物-病原菌、捕食关系、土壤食物网等)[11]。此外，在多种空间尺度下，生物间的相互作用(如种间竞争)都会影响物种在应对气候变化时的响应情况[11-12]。虽然我们对于动植物物种间交互作用关系对气候变化的敏感性研究已有比较深入的了解，但目前对微生物群落相互作用对气候条件的响应及其带来的土壤有机碳库的变化特征的认识还很有限。

本文基于土壤移置实验平台的土样，通过16S rRNA高通量测序的数据分析，利用CoNet (co- occurrence network inference)的微生物共生网络的构建方法研究气候变化背景下微生物群落内的潜在交互关系的变化趋势，及其对群落多样性的影响。

本研究是基于在中国东部南北样带(North-South Transect of Eastern China，NSTEC)选择中国科学院海伦、封丘、鹰潭农田生态系统国家野外科学观测研究站建立的土壤移置试验(2005年至今)。海伦农业生态试验站(126°38′E，47°26′N)，属于半湿润的寒温带季风气候，年均气温3.0 ℃，年均降水量530 mm。封丘农业生态试验站(114°24′E，35°00′N)，属半干旱、半湿润的暖温带季风气候，年均温为13.9 ℃，年降水量605 mm。鹰潭红壤生态试验站(116°55′E，28°15′N)，属于中亚热带湿润季风气候，年均温度17.6 ℃，年均降雨量1795 mm。2005年10月，分层(每层20 cm)采集3种土壤的剖面(1.2 m宽×1.4 m长×1 m深)，将每层土壤混匀后装袋运输到海伦、封丘和鹰潭试验站，按原来的土层顺序填装到试验小区的砖砌水泥池中(小区隔墙厚20 cm，露出地表 20 cm，底部铺石英沙，内壁覆盖防水布)。试验设置3个处理(3个重复)：①种植+施肥处理；②种植+不施肥；③裸地处理。

本实验选取土壤移置实验平台中的黑土移置部分作为本研究的研究对象，即将寒温带海伦试验站的黑土分别移置到暖温带的封丘以及中亚热带的鹰潭。土壤移置前的黑土基本理化性质如表 1所示。本文中将原位黑土简称为原位(in situ)，南移至封丘的黑土称为水热增加1 (warming 1)，南移至鹰潭的黑土称为水热增加2 (warming 2)。采集黑土移置实验2017年种植+施肥处理以及种植+不施肥土壤样品研究。用不锈钢土钻(2 cm)按“S”形采集微区表层15 cm耕层土壤，混合后采用四分法留取实验用土量，装入无菌密封塑料袋中4 ℃低温保藏带回。除去石块和根系，一部分土样风干后进行理化性质分析，另一部分放入-70 ℃冰箱，以备测定生物指标。

土壤pH采用玻璃电极测定，水土比2.5︰1，静置30 min后测定土壤pH；土壤有机质(OM)采用重铬酸钾容量法测定；全氮(TN)测定采用半微量开氏法；全磷(TP)采用碳酸钠熔融法，速效磷(AP)测定采用Olsen-P法，钼锑抗比色测定；土壤硝态氮(NO3--N)中性盐(KCl)浸提，连续流动分析仪(Skalar San++ System)测定。土壤的化学性质分析均采用常规农业化学分析方法[13]。

采用MO BIO试剂盒并结合液氮冷冻研磨的方法提取土壤样品中微生物基因组DNA。提取的DNA用Nanodrop 2000检测DNA的浓度及纯度，质量要求为：浓度≥20 ng/μL，总量≥500 ng，OD260/280=1.82.0。DNA置于-20 ℃保存备用。

对于合格的样本检测区域进行高保真PCR扩增，设置3个重复实验，同时以标准的细菌基因组DNA Mix作为阳性对照。其中对于2005年至2011年的样本，扩增序列为细菌的16S rRNA序列V4-V5区片段，引物采用带有barcode的通用引物Primer F=Illumina adapter sequence 1+ GTGCCAGCMGCCGCGG和Primer R=Illumina adapter sequence 2+ CCGTCAATTCMTTTRAGTTT；2017年的样本扩增序列为细菌的16S rRNA序列V4区片段，引物采用带有barcode的通用引物515 F (5ʹ-GTGCCAGCMGCCGCGG-3ʹ)和806 R (5ʹ-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3ʹ)。样本PCR反应体系(25 μL)包含1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，dNTP各0.4 mol/L，上下游引物各1.0 mol/L，0.5 U的DNA聚合酶(TaKaRa，Dalian)以及10 ng DNA模板。PCR反应程序为94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共25个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否单一和特异。将同一个样本的3个平行扩增产物混合，每个样本加入等体积的AgencourtAMpure XP(Beckman Coulter，USA)核酸纯化磁珠对产物进行纯化。

根据琼脂糖凝胶电泳的初步定量结果，对已经带有各自Index标签的样本文库浓度进行适当稀释，后利用Qubit对文库进行精确定量，根据不同样本的测序通量要求，按相应比例(摩尔比)混合样本。混样后的文库通过Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies，USA)检测测序文库插入片段的大小，确认在120-200 bp无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度。采用Miseq平台(Illumina，USA)，2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序，后续进行生物信息学分析。

利用CoNet构建网络分析，网络构建参数如下：首先将数据集中出现率小于1/3的OTU剔除，之后选择Pearson、Spearman和Bray-Curtis三种方法进行两两OTU相关性的评估，设置起始连线数为2000；为检验连线的显著性，设置置换(Permutation)次数、样品随机替代(bootstrap)次数均为1000。CoNet网络构建利用Cytoscape 3.4.0中的CoNet插件，网络拓扑性质的计算利用Network Analyzer插件；模块群落(Modules)的划分以及网络图形的编辑利用Gephi 0.9.2。在可视化网络结构图中，节点(通常以圆点表示)代表群落中的OTU，节点之间的连线代表OTU之间的相互作用关系(正、负相关性等)。

在评估网络枢纽节点时，我们假设网络中存在一些重要的微生物，因为其在共生网络中的中心位置而被称为枢纽微生物(Hub)，它们有可能对微生物群落的形成和保持有极为重要的作用。参考Agler等[14]的研究方法，利用R软件中的‘extremevalues’数据包对网络中所有节点的连接数的数据集进行正态分布的拟合，并计算在P=0.1的水平上哪些点为离群值，大于临界值连接数的节点则认为它们为网络中的枢纽。

采用IBM® SPSS® Amos 20.0 (AMOS IBM USA)进行结构方程模型(structural equation modeling；简称SEM)分析。首先对所有观测变量进行正态化检验，不能满足正态分布的变量对其取对数或者平方根处理，以提高其正态性。之后，采取极大似然法根据数据集对初始设定的先验模型进行参数化验证，测试其整体拟合优度。模型确定后，可以得到模型的路径系数(类似于偏相关系数，用以描述两个变量之间关系的强度以及正负关系)及其相关的P值，以及自变量对因变量的直接影响(direct effects)、间接影响(indirect effects)以及总影响(total effects)。

相关分析、方差分析(ANOVA)以及线性回归分析在SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，Illinois)完成。其中相关分析采用Pearson法；数据差异分析采用Duncan法。微生物群落的系统发育多样性是基于所有OTU的代表序列通过Mothur分析所得(https://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP#Phylogeny-based_analysis)。

通过采集原位和移置处理下的土壤样本，研究土壤移置对黑土微生物群落的影响。变形菌门、放线菌门、酸杆菌门及拟杆菌门是黑土中主要的细菌类群，水热条件的增加显著改变了放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌的相对丰度：将寒温带的黑土(in situ)移置到暖温带(warming 1)时，放线菌门和绿弯菌门的相对丰度变化较大；在中亚热带(warming 2)时，放线菌和酸杆菌的相对丰度变化最大。对微生物群落的多样性的分析表明，细菌的香浓指数和系统发育指数显著改变(表 2)，水热增加下细菌的香浓指数先增加后降低，而系统发育指数持续降低。

利用CoNet生态网络构建方法研究不同水热增加下微生物共生网络关系的变化(图 1，表 3)。结果显示，原位处理下连通度较大的微生物类群为放线菌门(Actinobacteria)；移置到封丘(warming 1)，酸杆菌门(Acidobacteria)与疣微菌门(Verrucomicrobia)的连通度较高；土壤南移至鹰潭(warming 2)，连通度较大的微生物类群为酸杆菌门(Acidobacteria)。

我们进一步分析了网络的拓扑性质(表 4)。原位下，土壤微生物共生网络包含431个节点、581条连线，其中64%为正连线，36%为负连线；南移至封丘后，微生物共生网络节点减少到309、连线数也降低到354，这可能是移置后导致环境突变，微生物的生存受到影响，这一点从共现关系类型中可以体现：56%为正连线，44%为负连线。说明环境突变可能会导致微生物关系从积极的促进关系转变为竞争关系；当南移至鹰潭后，环境变化更加剧烈，微生物共生网络节点减少到399，而连线数却增加到1810条，其中51%为正连线，49%为负连线，主要是负连接数的增加。表明环境变化越剧烈微生物的潜在竞争关系可能越频繁。同时，网络拓扑性质的分析结果还表明，南移至鹰潭后共生网络的密度(network density= 0.023)远高于南移至封丘(network density=0.007)以及原位(network density=0.006)。

为了对网络水平上的拓扑性质进行统计学分析比较，对每个独立样本基于以上3个网络分别提取子网络。对3个站点网络拓扑性质的分析结果见图 2。3个站点的网络总连线数、节点数、正负连线比例均有显著差异(P < 0.001)。有趣的是，共生网络的正负连线比例沿着水热梯度而变化，其中原位下的正负连线比例最高为1.97±0.12，南移至鹰潭后正负连线比例为1.05±0.16。

表 5统计了气候变化背景下，黑土微生物共生网络中连通度较高的主要类群之间的正负连线数。由此可见，在土壤主要的细菌类群中，同一个类群内部的交互作用以正连线为主，疣微菌门内部的连线数在3个站点均为最低；在黑土南移后，负连线最多的类群均为变形菌门与酸杆菌门(南移至封丘NE=16，南移至鹰潭NE=152)。基于以上对网络拓扑性质的分析，网络中的连线主要来源于土壤中占主导地位的细菌门，包括放线菌(占总连线数的20.0%-23.6%)、酸杆菌(16.3%-28.9%)、放线菌(11.1%-32.6%)。然而，这些细菌类群在3个站点所占的比例各异。当黑土移置到水热条件丰富的地区后，变形菌门与酸杆菌门的相对连线比例增加；而放线菌门的相对比例大幅度降低。其他一些细菌类群的相对比例也在移置后发生改变，包括芽单胞菌门、拟杆菌门。值得注意的是，虽然疣微菌门是黑土中相对丰度最高的细菌门类，但共生网络中该类群的连线较少，仅占8.2%-10.1%。此外，本研究结果发现随着土壤移置到水热充沛的地区后，负连线比例大大增加，这一结果表明移置后土壤微生物之间竞争作用可能增强。这些增加的负连线主要表现为变形菌门与其他各细菌门之间负连线的增加，尤其是变形菌门与酸杆菌门之间的负交互作用。酸杆菌门内部的负交互作用也在移置后增强。

通过拟合正态分布的方法分别得到3个站点微生物共生网络的枢纽节点(图 3)。其中，原位、增温1、增温2三个站点微生物共生网络中枢纽节点的连接数分别大于6、4、30。原位情况下，识别出的网络枢纽的节点数为58，增温1处理下的网络枢纽的节点数为42，增温1处理下的网络枢纽的节点数为46 (表 6)。

对以上识别出的3个站点的共生网络枢纽节点在门水平上进行划分(图 4)。原位的黑土微生物网络中的枢纽主要为放线菌(35%)、酸杆菌(19%)、疣微菌(17%)以及变形菌(17%)；南移至封丘后，黑土中的枢纽微生物主要由芽单胞菌(22%)、拟杆菌(19%)、变形菌(19%)、酸杆菌(17%)以及疣微菌(10%)组成；南移至鹰潭后，黑土中的枢纽微生物主要由酸杆菌(33%)、拟杆菌(17%)、变形菌(17%)、疣微菌(9%)以及芽单胞菌(9%)组成。对微生物共生网络枢纽节点的分析结果可见，酸杆菌和变形菌在3个网络模型中都占据较高的比例，气候的改变对其在生态网络中的地位影响较小。说明二者是维持网络稳定的重要枢纽节点。另外，虽然疣微菌门在为网络中的节点数相对较低，但这个门类的物种依然活跃在3个站点的生态网络中，也是网络中相对重要的枢纽。此外，土壤移置后放线菌在网络中的枢纽作用下降，由原位的35%下降为2%以及7%；相反，土壤移置后拟杆菌门和芽孢菌门在网络中的枢纽作用增强，拟杆菌门由原位的5%增加至增温1处理下的19%和增温2处理下的17%，而芽孢菌门由原位的0%增加至增温1处理下的22%和增温2处理下的9%。

为进一步探究微生物网络中的枢纽对群落多样性及群落组成的潜在影响，将网络中枢纽节点的丰度与群落多样性及群落组成指标做Pearson相关性分析，表 6列出了与这些微生物群落指标显著相关(P < 0.05)的枢纽节点数目。结果表明，在原位处理下，几乎所有识别出的网络枢纽的丰度显著影响着整个微生物群落的多样性(包括Shannon指数、物种丰富度、系统发育多样性)与组成；而当土壤移置到水热条件丰富的地区后，网络中的枢纽节点对群落指标的影响变弱，在南移至鹰潭的处理下，46个网络枢纽几乎只与群落结构相关。

为研究土壤微生物之间的交互作用对群落物种与系统发育多样性的影响，本研究利用SEM模型分析水热因子变化下土壤性质、微生物交互作用、多样性之间的直接、间接关系。对分类多样性与系统发育多样性预测的结构方程模型均可以通过参数检验(图 5)。其中网络大小与多样性指标的SEM模型参数检验总体符合要求：模型a的自由度=3，卡方值=2.455，P=0.484，GFI=0.979，RMESA < 0.001 (P=0.523)，Bollen-Stine p=0.498，模型b的自由度=3，卡方值=2.525，p=0.48471，GFI=0.978，RMESA < 0.001 (P=0.510)，Bollen-Stine P=0.577；网络连线与多样性指标的SEM模型参数检验基本符合要求(除RMESA外)：模型c的自由度=3，卡方值=4.237，P=0.237，GFI=0.964，RMESA=0.107(P=0.274)，Bollen-Stine P=0.214，模型d的自由度=3，卡方值=4.370，P=0.224，GFI= 0.963，RMESA=0.113 (P=0.261)，Bollen-Stine P= 0.259。基于SEM模型结果可见，在气候变化条件下微生物网络大小的指标对土壤微生物分类多样性的影响甚微(图 5-A，C)，但潜在改变了微生物系统发育多样性(图 5-B，D)。网络节点数(r=-0.42，P < 0.05)与总连线数(r=-0.51，P < 0.01)显著影响了系统发育多样性。同时，SEM模型结果表明微生物共生网络节点的大小对耕层土壤有机碳降低无显著的影响。

温度改变不仅会引起微生物群落多样性和分布格局的变化，同时也会改变物种之间相互作用关系[15]。本研究中土壤移置后导致的温度与降雨条件的改变显著改变了土壤微生物群落的潜在交互作用，具体表现为负连线比例的显著增加(图 1，表 4)。我们可以推测负连线比例的增加可能表明群落中负交互作用的增强，这种土壤微生物之间的负交互作用可能是竞争导致的。物种之间的竞争作用的一个典型例子就是基于“高斯假说”的生态位理论，即具相同的生态位不能共存[16]。本研究中负连线比例的增强主要体现为变形菌门与其他各细菌门之间负连线的增加，尤其是变形菌门与酸杆菌门之间的负交互作用，酸杆菌门内部的负交互作用也在移置后增强(表 5)。最近对酸杆菌门下的三个可培养物种的全基因组测序结果显示这些物种具有较宽的底物利用范围，而且能够应对干燥胁迫以及土壤湿度的大幅度变化[17]。酸杆菌的这些特性恰好解释了本研究中酸杆菌在移置后具有较高的竞争力。

气候变化下，微生物群落负连线比例的增加与微生物多样性的降低有直接联系(表 4，图 5-C、D)。这意味着群落中竞争作用的增强潜在降低了微生物多样性。这一结果与以往的研究结果类似，即当环境中的某种资源成为限制因子，这使得群落中具有相同生态位的物种竞争作用增强，从而导致物种的灭绝或者多样性的损失[18]。值得注意的是，当讨论潜在竞争关系时，不能忽略群落中非层级竞争(nontransitive competitive)。近来研究结果表明，非层级竞争是复杂植物群落维持较高多样性水平的重要机理[19]。事实上，虽然在纯培养体系中证明了微生物群落中同样遵循该规则[20]，但是在土壤环境中微生物群落是否存在这种非层级竞争关系仍有争议[21]。此外，本研究结果发现微生物共生网络的大小、节点数可能与土壤微生物的系统发育多样性有潜在的关系(图 5-B、D)，但是目前网络水平上的节点、连线这些表征微生物网络大小特性的指标很难与现有的生态理论知识结合[22]。因此在今后的研究中，进一步认识微生物网络大小的特性所指征的生态学意义很有必要。

本研究发现气候变化(温度)会直接导致土壤有机质的损失，而物种间的交互作用通过影响物种多样性可能间接地导致了土壤有机碳的降低(图 5)。表明水热增加下的物种间交互作用的改变可能直接导致了土壤碳的损失。Shade[23]认为具有较高微生物多样性的生态系统不一定是一个更好或者更健康的系统。这里我们的研究也同样表明，当评判某个生态系统的过程速率与微生物多样性之间的关系时，不能仅仅关注其多样性的增加或者降低，要利用多种测度评估微生物群落的特征，如微生物群落的交互作用。

综上所述，将寒温带的黑土移置到暖温带及中亚热带后，土壤微生物共生网络的性质发生显著变化。网络中表明微生物潜在竞争关系的负连线比例随着水热梯度显著增加，负连线比例的增加主要表现为变形菌门与酸杆菌门之间负交互作用的增强。识别了土壤微生物共生网络中的枢纽节点，且随着水热条件的增加，放线菌门在网络中的枢纽作用下降，拟杆菌门和芽孢菌门在网络中的枢纽作用增强。气候变化导致的温度与降水条件的变化一方面直接影响了分类多样性，另一方面气候因子通过直接和改变物种间交互作用间接改变了物种的多样性，并直接促进了土壤有机碳的降低。这种生物因素对多样性的直接影响甚至大于气候因子。因此，未来在探究环境压力下土壤微生物多样性改变的研究时，不但要重视非生物因子，更要重视生物因素对群落多样性的影响。